阪崎克羅諾桿菌表面蛋白的鑒定.pdf

1、阪崎克羅諾桿菌是近年來在奶粉（乳）制品行業(yè)中新發(fā)現(xiàn)的一種條件致病菌。它可以感染所有人群，其中，新生兒、早產(chǎn)兒感染該菌后有致命性的危險(xiǎn)，主要癥狀為腦膜炎、敗血癥及壞死性的小腸結(jié)腸炎和系統(tǒng)性膿毒病等。近年來，阪崎克羅諾桿菌的感染率提高很快，目前已引起世界多國(guó)相關(guān)部門的重視。
　　表面蛋白是合成后結(jié)合到細(xì)胞表面的一類蛋白，廣泛存在于革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌和古細(xì)菌的細(xì)胞壁表面，在營(yíng)養(yǎng)吸收、基礎(chǔ)代謝、侵入宿主等方面具有重要的功能。由于具

2、有刺激宿主免疫系統(tǒng)的作用，細(xì)菌表面蛋白的疫苗性能研究成為致病菌研究的熱點(diǎn)問題。此外，表面蛋白具有較好的免疫原性，將是一種有效的候選檢測(cè)靶標(biāo)。在阪崎克羅諾桿菌中，除外膜蛋白A研究較為深入外，其它表面蛋白的鑒定與功能研究開展非常少。
　　針對(duì)以上問題，本研究期望對(duì)阪崎克羅諾桿菌的表面蛋白進(jìn)行鑒定，為這一致病菌的溯源、致病機(jī)制、控制預(yù)防、檢測(cè)方法的建立等研究奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)前期的分型結(jié)果，選取5株阪崎克羅諾桿菌22＃(IQCC104

3、86)、27＃(90505)、29＃(ATCC29004)、37＃(ENS6607)、50＃(ENS07208)，利用固定后的菌體免疫新西蘭耳大白兔，免疫期間利用間接ELISA方法監(jiān)測(cè)血清效價(jià)，從而獲得相對(duì)應(yīng)的多克隆抗體;利用試劑盒分別提取5個(gè)菌株的膜蛋白并進(jìn)行脫鹽處理，分別做一維電泳和二維雙向電泳，以制備的多抗作為一抗進(jìn)行Western blot檢測(cè)，用PDquest軟件找到膠和膜能完全重合的點(diǎn)，即具有免疫原性的蛋白點(diǎn)，利用MALDI

4、-TOF MS對(duì)免疫原性蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。利用免疫蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，初步鑒定了5株菌中的48種表面蛋白，經(jīng)過軟件預(yù)測(cè)，包括9種外膜蛋白，2種周質(zhì)蛋白，2種細(xì)胞質(zhì)膜蛋白，35種細(xì)胞質(zhì)蛋白。5種菌中都鑒定出了外膜蛋白A30S和核糖體蛋白S1;延長(zhǎng)因子G和延長(zhǎng)因子Tu在4種菌中得到鑒定;分子伴侶GroEL等6種蛋白在3種菌中得到鑒定;熱激蛋白90等12種蛋白在2種菌中得到鑒定;蔗糖孔蛋白等26種蛋白僅在一種菌中得到鑒定。這些蛋白的功能和致病機(jī)