脂肪干細(xì)胞復(fù)合殼聚糖-膠原-硫酸軟骨素多孔支架體外成軟骨能力的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：冷凍干燥法制備殼聚糖—膠原—硫酸軟骨素三維支架，將其與大鼠脂肪干細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)，在成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下探討其作為軟骨組織工程支架的可行性，為關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：⑴支架材料的制備，將5％的膠原溶液與2％的殼聚糖乙酸溶液以7：3的體積比混勻。—80度冷凍2小時(shí)，冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥12小時(shí)，將凍干的支架切成直徑5mm高2mm的圓柱體。浸入2ml含50mmol/L2—嗎啉乙烷磺酸、50 mmol/L碳化二亞胺及

2、50 mmol/L N—羥基琥珀酰亞胺，2％硫酸軟骨素的體積分?jǐn)?shù)為40％的乙醇中室溫交聯(lián)6小時(shí)。0.1mol/L Na2HPO4(pH7.4)室溫孵育1.5h，體積分?jǐn)?shù)為0.4的乙醇清洗3次，30 min/次，雙蒸水反復(fù)洗至中性，再次冷凍干燥。即得殼聚糖—膠原—硫酸軟骨素支架材料。⑵細(xì)胞的分離，擴(kuò)增無菌條件下取SD大鼠雙側(cè)腹股溝脂肪組織，剪碎，0.25％胰蛋白酶和0.1％的膠原酶37度消化20分鐘，1000g離心8min，含10％胎牛血

3、清的DMEM重懸，接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至接近融合時(shí)胰酶/EDTA消化傳代。⑶細(xì)胞的種植和實(shí)驗(yàn)分組取第3代細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106/ml接種到支架上，實(shí)驗(yàn)組為成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。對照組培養(yǎng)基中除不含TGF-β1外，余與實(shí)驗(yàn)組相同。⑷觀察指標(biāo)的檢測：①光鏡觀察ADSC的生長，流式細(xì)胞學(xué)檢測脂肪干細(xì)胞的表面標(biāo)志；②體積法和稱重法測定支架材料的孔隙率和吸水性；③掃描電鏡及HE染色觀察支架材料的形態(tài)結(jié)構(gòu)和掃描電鏡觀察細(xì)胞支架復(fù)合物的

4、形態(tài)結(jié)構(gòu)；④免疫組織化學(xué)染色，RT-PCR，Western Blot檢測誘導(dǎo)后的脂肪干細(xì)胞的成軟骨表達(dá)。 結(jié)果：⑴支架材料內(nèi)部呈多孔的海綿狀結(jié)構(gòu)，各孔相互聯(lián)通，孔徑大小均一，孔徑大小約為100-120微米。細(xì)胞接種后24小時(shí)，與支架黏附良好。培養(yǎng)三周后細(xì)胞重疊生長，成多層狀，并分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)。⑵原代脂肪干細(xì)胞接種后24小時(shí)可見有少量的細(xì)胞貼壁，形態(tài)為小圓形，短梭形及多角形，3天后貼壁細(xì)胞明顯增多，類似成纖維細(xì)胞樣，約9天左

5、右細(xì)胞融合超過90％。流式細(xì)胞儀檢測表明，脂肪干細(xì)胞其表面CD29為80.2％，CD44為30.2％，而CD34，CD45的表達(dá)均不足5％。⑶培養(yǎng)三周后免疫組化染色結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組有被染成深棕黃色的區(qū)域，表明有Ⅱ型膠原的生成，而對照組染色幾乎為陰性⑷誘導(dǎo)培養(yǎng)三周后實(shí)驗(yàn)組有Ⅱ型膠原和蛋白聚糖mRNA條帶的表達(dá)，對照組幾乎無Ⅱ型膠原和蛋白聚糖mRNA的表達(dá)。⑸Western—blot檢測表明實(shí)驗(yàn)組有Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)，而對照組沒有。