Eag1鉀離子通道對(duì)宮頸癌HIF-1α的調(diào)控機(jī)制及其對(duì)中子放療影響的研究.pdf

1、研究目的： 宮頸癌(cervicalcancer)是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，放射治療一直是中晚期宮頸鱗癌患者主要的治療手段，雖然目前采用了中子照射、組織間腔內(nèi)治療等治療新技術(shù)，但仍有30％-～40％的患者治療失敗，其主要原因是局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。 放射治療失敗的主要原因是腫瘤中心乏氧細(xì)胞對(duì)放療不敏感，常規(guī)放療劑量不能完全消滅腫瘤細(xì)胞，殘存的腫瘤細(xì)胞通過(guò)加速再增殖很快復(fù)發(fā)，有多種基因參與這一過(guò)程，其中缺氧誘導(dǎo)因子1α(hyp

2、oxiainduciblefactor1α，HIF-1α)起關(guān)鍵作用，HIF-1α是一個(gè)在缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的核轉(zhuǎn)錄因子，在多種腫瘤組織中高表達(dá)。很多因素都對(duì)HIF-1α有調(diào)控作用，其中缺氧是其主要的調(diào)控因素之一。但其具體的調(diào)控機(jī)制尚不十分清楚。 Eag1鉀離子通道屬電壓門控性鉀通道，含6個(gè)跨膜區(qū)(S1～S6)的單孔通道，通過(guò)去極化而激活。正常情況下其分布十分局限，專一分布于大腦，僅在成肌細(xì)胞(即將融合前)和胎盤中有少量表達(dá)，但

3、在多種腫瘤中存在高表達(dá)。目前認(rèn)為Eag1通道形成的四聚體中的每一個(gè)單體有六個(gè)假定的主要包含電壓傳感蛋白的跨膜區(qū)(富含正電荷氨基酸)，并且它的細(xì)胞內(nèi)C端有一個(gè)Per-Arnt-Sim(PAS)區(qū)，即氧感受器，對(duì)缺氧感受起重要作用。腫瘤組織中抑癌基因VHL(vonHippel-Lindau)表達(dá)降低可激活Eag1通道，增強(qiáng)HIF-1α的穩(wěn)定性，上述研究結(jié)果提示Eag1通道可能在腫瘤細(xì)胞缺氧感受及HIF-1α的調(diào)控中起重要的作用。但缺氧條件下

4、Eag1通道對(duì)宮頸癌細(xì)胞HIF-1α表達(dá)調(diào)控方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。本課題通過(guò)研究缺氧條件下Eag1表達(dá)和活性的變化以及該鉀離子通道對(duì)HIF-1α調(diào)控作用，同時(shí)觀察鉀通道阻斷劑對(duì)。Hela細(xì)胞中子照射的影響，以期為提高中晚期宮頸癌患者中子放射治療效果提供理論依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法： 1.采用免疫組化方法，檢測(cè)不同宮頸組織中Eag1和HIF-1α蛋白的表達(dá)情況；采用免疫熒光、RT-PCR、Western-blot等方法，檢測(cè)不同缺氧

5、條件以及使用Eagl鉀離子通道阻斷劑情況下Hela細(xì)胞中Eag1與HIF-1αmRNA和蛋白表達(dá)的特點(diǎn)及其相關(guān)性。 2.采用全細(xì)胞膜片鉗記錄的方法，觀察常氧及缺氧條件下宮頸癌Hela細(xì)胞膜上Eagl鉀離子通道電生理特點(diǎn)，研究缺氧對(duì)其通道活性的影響。 3.采用激光共聚焦方法，觀察缺氧條件下.Eag1鉀離子通道活性對(duì)細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i、線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)、線粒體膜電位(△())的影響；采用電鏡觀察缺氧條件下線

6、粒體超微結(jié)構(gòu)的變化；采用流式細(xì)胞儀及高效液相色譜分析法檢測(cè)缺氧條件下Eag1鉀離子通道開(kāi)放狀態(tài)對(duì)活性氧(ROS)、ATP、ADP、AMP以及能荷生成的影響。 4.采用MTT、流式細(xì)胞儀、RT-PCR和Western-blot等方法，檢測(cè)不同濃度鉀離子阻斷劑4-氨基吡啶(4-AP)對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞中子照射后細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率以及HIF-1αmRNA和蛋白表達(dá)的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.免疫組化結(jié)果表明，宮頸上

7、皮內(nèi)瘤變組織內(nèi)Eag1與HIF-1α蛋白的表達(dá)均明顯高于正常組，宮頸癌組織內(nèi)Eag1與HIF-1α蛋白的表達(dá)明顯高于宮頸上皮內(nèi)瘤變組；Ⅰ＋Ⅱ期宮頸癌組織中Eag1與HIF-1α表達(dá)明顯高于0期，Ⅲ+Ⅳ期宮頸癌組織內(nèi)Eagl與HIF-1α表達(dá)明顯高于Ⅰ＋Ⅱ期，Eag1和HIF-1α的表達(dá)均與病理分級(jí)無(wú)明顯相關(guān)性，Eag1蛋白表達(dá)與HIF-1α表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.520，p＜0.01)。 免疫熒光、RT-PCR、Western-b

8、lot結(jié)果表明，正常培養(yǎng)條件下宮頸癌Hela細(xì)胞中即有Eag1及HIF-1α蛋白表達(dá)；缺氧條件下，隨缺氧程度加深及缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)均明顯增強(qiáng)，Eag1鉀離子通道阻斷劑能明顯減弱HIF-1α的表達(dá)和轉(zhuǎn)位。 2.全細(xì)胞膜片鉗記錄結(jié)果表明，Hela細(xì)胞中Eag1鉀離子通道是電壓依賴性的，具有延遲整流及不失活特性；輕度缺氧條件能使Hela細(xì)胞膜電位增大，Eag1鉀離子通道電流強(qiáng)度增大、激活時(shí)間縮短。 3.輕度缺氧條件下Ea

9、g1鉀離子對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的影響有以下幾個(gè)方面：(1)細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度升高；(2)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放；(3)線粒體膜電位降低；(4)線粒體出現(xiàn)數(shù)量增多，體積增大、嵴增多等改變；(4)ROS生成增多；(5)線粒體呼吸功能增強(qiáng)；(6)細(xì)胞儲(chǔ)備能力增強(qiáng)。而鉀離子通道阻斷劑能減弱上述變化。 4.給予不同濃度鉀離子通道阻斷劑4-AP后，在相同缺氧條件和中子照射劑量下，Hela細(xì)胞的增殖抑制率、凋亡率與鉀離子通道阻斷劑4-

10、AP濃度呈正相關(guān)，HIF-1αmRNA和蛋白表達(dá)與鉀離子通道阻斷劑4-AP濃度呈負(fù)相關(guān)。 主要結(jié)論： 1.Eag1和HIF-1α蛋白表達(dá)均與宮頸癌病變發(fā)展程度相關(guān)，其表達(dá)均隨宮頸癌臨床分期升高而增加，與病理分級(jí)無(wú)明顯相關(guān)性，Eag1與HIF-1α表達(dá)呈正相關(guān)；正常培養(yǎng)的宮頸癌Hela細(xì)胞內(nèi)有EaglmRNA表達(dá)，其表達(dá)量受缺氧程度和時(shí)間的影響；缺氧條件下.Eag1鉀通道對(duì)HIF-1α的表達(dá)起一定的調(diào)控作用。 2.

11、缺氧條件下Hela細(xì)胞膜上Eag1鉀離子通道有電生理活動(dòng)的改變，提示Eag1在細(xì)胞缺氧感受中起重要的作用。 3.Eag1鉀離子通道活性改變對(duì)線粒體結(jié)構(gòu)和功能有重要的影響，缺氧條件下Eag1可能通過(guò)改變線粒體結(jié)構(gòu)和功能調(diào)控HIF-1α的表達(dá)。 4.鉀通道阻斷劑4-AP能明顯降低相同缺氧條件、相同中子照射劑量下Hela細(xì)胞內(nèi)HIF-1αmRNA和蛋白表達(dá)水平，增加細(xì)胞的增殖抑制率和凋亡率，增強(qiáng)放療效果，這將為中晚期宮頸鱗癌的