HBV對低氧誘導肝癌細胞HIF-1α表達的影響及其機制研究.pdf

1、目的：原發(fā)性肝癌是常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在世界范圍內居惡性腫瘤的第五位，死亡率居第三位，而在我國年發(fā)病率居第三位，年患病率約為10～150/10萬人，死于原發(fā)性肝癌的患者約32萬人/年。根據(jù)回顧性調查結果表明原發(fā)性肝癌的發(fā)病率有逐年增加的趨勢，HBV感染引起的慢性乙型肝炎是原發(fā)性肝癌最重要的病因之一。針對原發(fā)性肝癌進展迅猛、高侵襲性，血管密度高等特性，臨床上已有針對血液供應的治療策略，如血管栓塞、抗VEGFR生物治療等，但預后并不理

2、想。針對腫瘤細胞增殖迅速相對低氧的微環(huán)境，課題組前期研究證明低氧誘導HIF-1α的表達可上調HSP70-2表達從而抵抗凋亡，HepG2與HBV穩(wěn)定復制的HepG2.215細胞間熱休克蛋白70-2的表達存在差異，其機制尚不清楚。鑒于此，本課題探討了低氧微環(huán)境下，肝癌細胞HepG2及HBV穩(wěn)定復制的HepG2.215的增殖、凋亡及凋亡相關基因survivin、轉錄因子HIF-1?及VEGF的表達變化及機制，為以其為靶點的干預研究奠定基礎。<

3、br>　　方法：①細胞增殖試驗：采用CCK-8試劑盒檢測低氧條件下，L02/HepG2/HepG2.215細胞在不同時間點（0h、24h、48h、72h）OD值，以及通過細胞染色等方法檢測細胞的增殖；②細胞凋亡檢測：采用AnnexinV-FITC和PI雙染色FCM檢測L02/HepG2/HepG2.215細胞在1％低氧條件下，0h/3h/6h/12h/24h/48h/72h的凋亡與壞死；③免疫印跡：采用WesternBlot檢測1%低氧

4、條件下，不同時間點（0h/3h/6h/12h/24h/48h/72h）L02/HepG2/HepG2.215細胞內HIF-1?/VEGF/Survivin的表達；④miRNA基因芯片及microRNA檢測：用trizol法提取HepG2細胞和HepG2.215細胞的總RNA，用miRNA基因芯片檢測兩種細胞中miRNA的表達差異。對有表達差異的miRNA采用生物信息學方法分析針對HIF-1?的miRNA表達的差異；⑤細胞趨化實驗：1×1

5、04L02/HepG2/HepG2.215細胞放置于transwell小室中的下室，1×103THP-1細胞置于上室，低氧條件下培養(yǎng)48h，常規(guī)固定及結晶紫染色檢測通過PMA誘導的THP-1分化為巨噬細胞的趨化；⑥Arg1、Fizz1、iNOS的表達的檢測：1×105L02/HepG2/HepG2.215細胞1%低氧培養(yǎng)48h后，取上清與1×104THP-1細胞共培養(yǎng)48h，RT-PCR檢測PMA誘導THP-1分化為巨噬細胞后Arg1、

6、Fizz1、iNOS的表達。
　　結果：⑴細胞增殖實驗結果表明，低氧條件下培養(yǎng)72hL02/HepG2/HepG2.215的增殖率均分別高于普通組，提示低氧微環(huán)境有利于L02/HepG2/HepG2.215細胞的增殖。⑵AnnexinV/PI雙染色FCM檢測細胞凋亡結果表明，在1%低氧條件下培養(yǎng)72h，L02/HepG2/HepG2.215細胞凋亡率低于普通培養(yǎng)組，但無統(tǒng)計學差異,結果提示低氧并不促進細胞凋亡。⑶WB結果顯示，He

7、pG2細胞及HepG2.215細胞內HIF-1?表達在低氧6h后達到高峰，并維持在高于正常水平；LO2細胞HIF-1表達在低氧48h后達到高峰，維持在高于正常水平；在各時間點中，HepG2.215細胞內HIF-1?表達均顯著高于HepG2細胞，結果提示低氧可誘導肝癌細胞高表達HIF-1，且HBV穩(wěn)定表達的細胞其表達增高更為顯著；3種細胞survivin蛋白的表達在低氧12h均達到高峰，48h有下降趨勢，但仍高于對照組。⑷miRNA基因芯

8、片檢測，通過生物信息學分析，與HepG2細胞相比，發(fā)現(xiàn)HepG2.215細胞靶向HIF-1的miRNA（miR-2392，miR-3945，miR-1914-3p，miR-1236-5p和miR-4253）表達下調。⑸與普通培養(yǎng)相比，1%低氧環(huán)境下，肝癌細胞HepG2/HepG2.215培養(yǎng)上清對PMA誘導的THP-1細胞分化為巨噬細胞的趨化能力減弱，但促進PMA誘導THP-1細胞分化的巨噬細胞向M2極化，抑制其向M1極化。
　　

9、結論：①低氧環(huán)境培養(yǎng)下L02/HepG2/HepG2.215細胞凋亡率相對降低，而細胞增殖率顯著增高，并誘導HIF-1α和survivin高表達，提示其對于肝癌細胞耐受低氧并促進其增殖發(fā)揮著重要作用；②低氧環(huán)境培養(yǎng)下HBV穩(wěn)定表達的HepG2.215細胞HIF-1α上調更為顯著，并維持較高水平，可能與HBV穩(wěn)定表達的肝癌細胞靶向HIF-1α的miRNA下調有關，詳細機制有待于進一步深入研究；③低氧誘導的肝癌細胞培養(yǎng)上清雖然趨化PMA誘導