旋毛蟲COXⅠ基因多態(tài)性分析和成囊前期幼蟲檢疫方法的研究.pdf

1、旋毛蟲病是一種嚴(yán)重的食源性人獸共患寄生蟲病,主要因生食或半生食含有旋毛蟲幼蟲囊包的肉及肉制品所致。由于旋毛蟲屬內(nèi)不同蟲種的地理分布、宿主范圍、致病性以及宿主對不同蟲種的免疫應(yīng)答等方面存在有明顯差異,因此,旋毛蟲屬分類的研究對旋毛蟲病的病原學(xué)、免疫學(xué)、流行病學(xué)、臨床及預(yù)防控制等均具有重要意義。旋毛蟲不僅嚴(yán)重危害人類健康,也給養(yǎng)豬業(yè)和食品工業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。在歐共體,法律規(guī)定在其15個(gè)成員國內(nèi)飼養(yǎng)的生豬必須進(jìn)行旋毛蟲檢疫,其費(fèi)用約為5.

2、7億美元;在我國,旋毛蟲是強(qiáng)制性肉類檢疫項(xiàng)目,每年用于豬肉旋毛蟲檢疫的費(fèi)用達(dá)18億元。為了對我國旋毛蟲不同地理株進(jìn)行分子鑒定和多態(tài)性分析,本文應(yīng)用PCR-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RLFP)和PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)技術(shù),對我國7個(gè)旋毛蟲地理株的細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ(COXⅠ)基因片段進(jìn)行分析。
　　本文還對旋毛蟲肌幼蟲在不同宿主肌肉中的分布、囊包內(nèi)幼蟲含量以及目前國內(nèi)外普遍應(yīng)用的肉類及肉制品中旋毛蟲(尤其成囊前

3、期幼蟲)檢疫方法的敏感性及其影響因素進(jìn)行了觀察。
　　材料與方法1.旋毛蟲與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本實(shí)驗(yàn)所用蟲種為旋毛蟲(T1)、鄉(xiāng)土旋毛蟲(T2)、布氏旋毛蟲(T3)、偽旋毛蟲(T4)及納氏旋毛蟲(T7);7個(gè)豬源旋毛蟲地理株來自河南、湖北、云南、西安、哈爾濱、同江及天津。健康雄性昆明小鼠和Sprague Dawley(SD)大鼠購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。2.旋毛蟲肌幼蟲基因組DNA的提取及PCR擴(kuò)增酚氯仿法提取旋毛蟲肌幼蟲基因組DNA,使用旋

4、毛蟲COXⅠ基因的簡并引物:L6625(5’-TTYTGRTTYTTYGGNCAYCC-3’):H7005(5’-ACNACRTARTANGTRTCRTG-3’)。對所提取的旋毛蟲肌幼蟲基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。3.PCR-RFLP使用Trull(MseI)限制性內(nèi)切酶對純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切,3％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物,用凝膠圖像分析儀觀察并分析酶切結(jié)果。4.PCR-SSCP將純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP,8％非變性聚丙烯

5、酰胺凝膠電泳檢測SSCP結(jié)果,電泳后銀染顯色。通過計(jì)算獲得等位基因頻率、基因型頻率以及多態(tài)性信息含量。5.旋毛蟲幼蟲在大鼠與小鼠肌肉分布及囊包內(nèi)幼蟲數(shù)量的觀察將30只昆明小鼠和30只SD大鼠均隨機(jī)分為輕、中、重度感染組,每組10只,分別按每g體重1、5、20條肌幼蟲經(jīng)口感染。感染后40d剖殺,取不同部位肌肉稱重后壓片鏡檢,觀察不同部位每g肌肉蟲荷(larvae per gram,lpg)及囊包內(nèi)幼蟲數(shù)量。6.ICT-消化法對肉中旋毛蟲肌

6、幼蟲檢測的敏感性觀察按每g肌肉1~5條幼蟲加入正常豬肉樣本中,人工消化后鏡檢,觀察不同蟲荷的檢出率。7.成囊前期幼蟲(PEL)的檢疫3組小鼠分別用20、10及5條幼蟲感染,感染后18d剖殺,應(yīng)用國際旋毛蟲病委員會(huì)推薦的消化法(ICT-消化法)、我國國家標(biāo)準(zhǔn)-豬旋毛蟲病診斷技術(shù)GB/T18642-2002(國標(biāo)消化法)和貝氏法,對感染后18d的成囊前期幼蟲進(jìn)行檢驗(yàn),比較3種方法的檢疫效果。
　　結(jié)果：1.旋毛蟲不同種和地理株COXⅠ

7、基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果對5個(gè)旋毛蟲國際參考株和我國7個(gè)旋毛蟲地理株COXⅠ基因片段擴(kuò)增后電泳結(jié)果表明,上述5種旋毛蟲和7個(gè)地理株的擴(kuò)增片段大小一致(約為419bp)。2.PCR-RFLP檢測結(jié)果對5種旋毛蟲和7個(gè)地理株COXⅠ基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Trull(MseI)酶切后發(fā)現(xiàn)T2、T3、T4、T7和天津株均具有獨(dú)特的酶切帶型:T2(22bp,70bp,327bp),T3(92bp,327bp),T4(419bp),T7(62bp,

8、64bp,70bp,223bp),天津株(92bp,126bp,201bp);其他6個(gè)地理株的酶切帶型和T1一致(22bp,70bp,126bp,201bp)。3.PCR-SSCP分析結(jié)果對我國7個(gè)旋毛蟲地理株與波蘭株COXⅠ基因擴(kuò)增片段進(jìn)行SSCP檢測,發(fā)現(xiàn)有3種基因型(AA、AB和BB):波蘭株為AA型;哈爾濱、黑龍江同江、西安、云南、湖北及河南株均為AB型;天津株為BB型。以AB基因型頻率最高(0.75),AA與BB基因型均為0.

9、125:A和B等位基因頻率相等,均為0.5;旋毛蟲不同地理株COXⅠ基因的多態(tài)性信息含量(PIC)為0.375,為中度多態(tài)性。4.旋毛蟲幼蟲在大鼠與小鼠肌肉分布及囊包內(nèi)幼蟲數(shù)量大鼠在輕度感染時(shí)以咬肌蟲荷最高,中、重度感染時(shí)分別以膈肌和舌肌蟲荷最高;小鼠在輕度感染時(shí)以咬肌蟲荷最高,中、重度感染時(shí)均以膈肌蟲荷最高。在大鼠肌肉內(nèi)8028個(gè)囊包中,含1、2、3條幼蟲的囊包分別占97.91％、1.95％及0.14％;在小鼠肌肉內(nèi)7559個(gè)囊包中,

10、含1、2、3條幼蟲的囊包分別占97.33％、2.54％及0.13％。小鼠肌肉內(nèi)多幼蟲(2~3條)囊包的檢出率明顯高于大鼠(χ2=5.644,P<0.05)。多幼蟲囊包的檢出率在大鼠和小鼠均隨感染劑量的增加而升高(χ大鼠2=42.656,P<0.05;χ小鼠2=45.713,P<0.05);在含3條幼蟲囊包的肌肉內(nèi),重度感染的大鼠和小鼠肌肉分別占81.82％(9/11)與100％(10/10)。未發(fā)現(xiàn)含有4條及4條以上幼蟲的囊包。5.IC

11、T-消化法對肉中旋毛蟲肌幼蟲檢測的敏感性觀察每g含5、4及3條幼蟲的各10份豬肉,ICT-消化法的檢出率均為100％;每g含2、1條幼蟲的各10份豬肉,檢出率僅分別為30％和10％。6.三種方法對成囊前期幼蟲檢驗(yàn)結(jié)果的比較旋毛蟲幼蟲感染小鼠后18d,每只感染20條幼蟲的15份小鼠肌肉,ICT-消化法、國標(biāo)消化法與貝氏法的幼蟲檢出率均為100％(χ202=0.000,P>0.05);每只感染10條幼蟲的15份小鼠肌肉,3種方法的檢出率分別

12、為93.33％,93.33％及100％(χ102=1.645,P>0.05);每只感染5條幼蟲的30份小鼠肌肉,3種方法的檢出率分別為63.33％,90％及100％(χ52=18.866,P<0.05)。
　　結(jié)論1.我國7個(gè)旋毛蟲地理株及波蘭株的COXⅠ基因片段的遺傳變異度為中度多態(tài)性;我國旋毛蟲地理株中,河南、湖北、云南、西安、哈爾濱及同江株可歸為一類,天津株可歸為另一類。2.對鼠類進(jìn)行旋毛蟲感染的病原學(xué)檢查時(shí)應(yīng)首選咬肌,其次