旋毛蟲肌幼蟲親肌肉抗原基因的克隆、表達(dá)及免疫學(xué)特性的研究.pdf

1、旋毛蟲病是一種由旋毛蟲感染引起的食源性人獸共患寄生蟲病,可以感染人和多種哺乳動(dòng)物。人類主要因生食或半生食含有幼蟲囊包的豬肉而感染。隨著人們飲食習(xí)慣的改變,野生動(dòng)物和馬肉成為人旋毛蟲病的新感染源。世界上許多國(guó)家都有該病爆發(fā)的報(bào)道,該病對(duì)動(dòng)物養(yǎng)殖和食品安全都產(chǎn)生了較大影響。因此,研制抗旋毛蟲病的疫苗具有較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
　　預(yù)防寄生蟲感染的常用方法是利用其天然抗原或重組蛋白抗原對(duì)宿主進(jìn)行免疫,宿主體內(nèi)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體進(jìn)而起到保護(hù)作用。利

2、用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法,已有旋毛蟲蟲體提取物、ES產(chǎn)物及其它重組蛋白疫苗研究的報(bào)道。如p43、p53核酸疫苗,經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí),該疫苗對(duì)宿主具有一定的免疫保護(hù)作用。但是旋毛蟲抗原成分非常復(fù)雜,并且不同發(fā)育期具有特異性,已經(jīng)研制出的核酸疫苗保護(hù)作用一般,我們應(yīng)該積極尋找更加有效的抗原基因。
　　從本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的旋毛蟲感染動(dòng)物模型中,利用人工消化法收集肌幼蟲,利用RT-PCR的方法克隆一個(gè)新的旋毛蟲肌幼蟲基因。測(cè)序結(jié)果與已發(fā)表的基因序列比對(duì)

3、,結(jié)果證實(shí)二者來(lái)自同一基因。再利用原核表達(dá)、蛋白純化、Western Blot的方法,獲得重組蛋白,結(jié)果證實(shí)該蛋白具有抗原性,為疫苗的研制打下理論基礎(chǔ)。
　　目的:
　　克隆一個(gè)新的旋毛蟲肌幼蟲基因即親肌肉抗原(Myophilin),并分析其序列同源性。然后進(jìn)行原核表達(dá),并對(duì)表達(dá)出的蛋白利用Western Blot的方法分析其免疫學(xué)特性,為旋毛蟲病疫苗的研制提供理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　在GenBank旋毛蟲基

4、因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索,獲得旋毛蟲親肌肉抗原的cDNA序列,利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物(上下游引物分別含NdeⅠ、XhoⅠ酶切位點(diǎn))。收集云南株旋毛蟲肌幼蟲,提取總RNA,并以此為模板進(jìn)行RT-PCR。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳,目的基因切膠回收后與克隆載體 pMD-19T分別用 NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切,酶切產(chǎn)物以3:1連接,然后轉(zhuǎn)化到DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,Amp抗性培養(yǎng)基培養(yǎng)。陽(yáng)性克隆提質(zhì)粒后做 PCR及雙酶切

5、鑒定,陽(yáng)性菌液進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與檢索基因核苷酸序列通過(guò)DNAMAN軟件比較,分析其同源性。測(cè)序結(jié)果完全正確后構(gòu)建原核表達(dá)重組體pET22b-Myophilin,轉(zhuǎn)化到BL21中,陽(yáng)性菌液鑒定成功后IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌內(nèi)表達(dá),His-tag標(biāo)簽純化蛋白,經(jīng)SDS-PAGE鑒定重組蛋白及純化蛋白。用Western blot對(duì)該蛋白的免疫原性進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　1親肌肉抗原的RT-PCR擴(kuò)增:2%瓊脂糖凝膠電泳顯示,RT

6、-PCR擴(kuò)增得到1條約579bp的條帶,與預(yù)期大小相符,表明成功擴(kuò)增出目的基因Myophilin。
　　2重組克隆質(zhì)粒的PCR及酶切鑒定:以重組質(zhì)粒為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定,得到1條與目的片段大小一致的條帶,確認(rèn)目的基因克隆成功。重組質(zhì)粒經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切,獲得大小分別為2600bp、579bp和300bp左右的3條帶,與預(yù)期結(jié)果相符,再次驗(yàn)證目的基因克隆成功。
　　3親肌肉抗原序列測(cè)定及其同源性

7、分析:所測(cè)親肌肉抗原基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST,同源性為100%。
　　4重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定:表達(dá)載體pET22b利用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切,將目的基因與表達(dá)載體的連接產(chǎn)物提質(zhì)粒,做質(zhì)粒 PCR得到一條579bp的條帶,雙酶切獲得大小分別為5500bp和579bp的2條帶,與理想結(jié)果相符,證明連接成功。
　　5重組蛋白的純化鑒定:重組蛋白經(jīng)6*His標(biāo)簽的鎳柱親和層析純化后得到一條蛋白條帶,分子量約21k

8、Da。
　　6 Western Blot鑒定免疫特性:將純化蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)印,以感染40天旋毛蟲小鼠的血清為一抗進(jìn)行Western Blot,顯色時(shí)在21kDa處有條帶,說(shuō)明Myophilin具有抗原性。
　　結(jié)論:
　　1成功提取出旋毛蟲肌幼蟲總RNA,克隆出Myophilin基因。
　　2構(gòu)建了Myophilin基因的原核表達(dá)載體重組體。
　　3誘導(dǎo)表達(dá)出Myophilin蛋白,并成功純