旋毛蟲肌幼蟲冷凍耐力與同工酶分析及成囊前幼蟲感染性的研究.pdf

1、旋毛蟲病(trichinellosis)是一種嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病。目前全世界大約有1100萬人體感染者,現(xiàn)已被列入再度肆虐的疾病(re-emerging disease)。由于旋毛蟲屬不同種的地理分布、宿主范圍、冰凍耐力、對(duì)宿主的感染性與致病性及宿主對(duì)不同蟲種的免疫應(yīng)答等方面存在有明顯差異,故旋毛蟲屬分類的研究對(duì)旋毛蟲病的病原學(xué)、免疫學(xué)、流行病學(xué)、臨床學(xué)及預(yù)防等均有重要意義。目前國(guó)際旋毛蟲病委員會(huì)推薦應(yīng)用的肉類中旋毛蟲檢疫的方法是消

2、化法,我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)“豬旋毛蟲病診斷技術(shù)”規(guī)定對(duì)屠宰豬肉中的旋毛蟲檢疫方法亦是消化法。一般認(rèn)為旋毛蟲感染宿主后約1個(gè)月在幼蟲周圍形成囊包,但成囊前期幼蟲對(duì)新宿主是否具有感染性以及能否用消化法進(jìn)行檢疫,目前尚不清楚。
　　本文對(duì)我國(guó)旋毛蟲不同地理株的冷凍耐力與同工酶進(jìn)行了分析,并對(duì)旋毛蟲成囊前期幼蟲的感染性及消化后的存活情況進(jìn)行了觀察。
　　材料與方法：1.旋毛蟲蟲種與地理株本實(shí)驗(yàn)所用蟲種為旋毛蟲(T1)、鄉(xiāng)土旋毛蟲(T2)、布

3、氏旋毛蟲(T3)、偽旋毛蟲(T4)及納氏旋毛蟲(T7);6個(gè)豬源旋毛蟲地理株來自湖北、天津、哈爾濱、同江、云南(大理)及河南(南陽)。2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與肌幼蟲收集4周齡健康雄性昆明小鼠,每只體重18g~20g,購自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將不同種和地理株旋毛蟲感染小鼠后42天拉頸處死,全身肌肉人工消化后收集純凈的旋毛蟲肌幼蟲。3.冷凍耐力試驗(yàn)將60只小鼠隨機(jī)分成3組,每組20只。將分別感染T2、河南株與云南株肌幼蟲的小鼠在感染后42天剖

4、殺,制備肉樣,每份重約5克,約50mm×6mm×6mm,置于5ml EP管中-18℃分別保存6h、12h、24h、48h。肉樣室溫解凍后壓片鏡檢,每組小鼠感染300條冰凍保存不同時(shí)間的幼蟲。另取10只小鼠分為2組作為對(duì)照組,分別感染T2與河南株的正常肌幼蟲。所有感染小鼠均在感染后42天后剖殺,全身肌肉消化后貝氏法收集肌幼蟲,計(jì)算生殖力指數(shù)(reproductive capacity index,RCI),觀察T2、河南株與云南株肌幼蟲的

5、冷凍耐力。生殖力指數(shù)(RCI)=實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染后42天回收的肌幼蟲數(shù)/接種的肌幼蟲數(shù)。4.同工酶試驗(yàn)將旋毛蟲不同種與地理株的純凈肌幼蟲加酶穩(wěn)定劑后制備勻漿,離心后取上清作為粗酶液。將粗酶液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE),染色,用GeneGenius凝膠圖像分析儀對(duì)酶譜進(jìn)行分析。5.小鼠感染旋毛蟲后14-21天3種方法的檢測(cè)將80只小鼠隨機(jī)分成8組(每組10只),每組感染旋毛蟲河南株肌幼蟲300條,感染后14-21天每天采血后剖殺1組,

6、分別用鏡檢法(膈肌壓片)與貝氏法(小鼠肌肉剪碎)觀察成囊前期幼蟲的檢出率;用ELISA檢測(cè)小鼠血清抗體水平。6.不同日齡成囊前期幼蟲對(duì)小鼠感染性的觀察①將感染旋毛蟲后14~21天的小鼠膈肌(即含8~15日齡的成囊前期幼蟲)壓片鏡檢,將含幼蟲的膈肌喂飼小鼠,42天后剖殺,肌肉消化后觀察收集的幼蟲數(shù)。②將貝氏法收集的8~15日齡成囊前期幼蟲灌胃感染小鼠(每只300條),42天后剖殺,肌肉消化后觀察收集的幼蟲數(shù)。③另取10只小鼠作為對(duì)照,每只

7、經(jīng)口感染300條成囊期(肌)幼蟲,42天后剖殺,肌肉消化后觀察收集的幼蟲數(shù)。7.小鼠感染旋毛蟲后不同時(shí)間血清抗體水平觀察將12只健康昆明小鼠每只經(jīng)口感染300條旋毛蟲肌幼蟲,感染后11-28天ELISA觀察血清抗體水平的變化。
　　結(jié)果：1.冷凍耐力試驗(yàn)含有旋毛蟲河南株、云南株和T2肌幼蟲的小鼠肉樣-18℃保存不同時(shí)間后感染小鼠,河南株-18℃保存6h及12h后的RCI分別為0.03和0;云南株-18℃保存6h、12h及24h后的

8、RCI分別為0.04、0.01和0;T2-18℃保存6h、12h、24h、48h后的RCI分別為26.8、21.9、10.8和7。經(jīng)方差分析,T2的RCI總體差異顯著(F=6.763,P<0.05),在6h與12h以及24與48h之間的差異無顯著性(P>0.05),但在12h與24h之間差異有顯著性(P<0.05),提示T2肌幼蟲-18℃保存12h后感染性有明顯下降。2.同工酶試驗(yàn)超氧化物岐化酶在6個(gè)地理株的酶帶遷移率與T1和T4相同,

9、與T2、T3及T7明顯不同;蘋果酸酶的酶帶遷移率在黑龍江株和同江株與其他4個(gè)地理株稍有不同,6個(gè)地理株與T3均明顯不同;酯酶的酶帶遷移率在6個(gè)地理株與5種旋毛蟲之間無明顯差別;谷氨酸脫氫酶的酶帶遷移率在6個(gè)地理株與T4、T7明顯不同,與其他蟲種無明顯差異。3.小鼠感染旋毛蟲14~21天3種方法的檢測(cè)結(jié)果小鼠感染旋毛蟲后14、15天,鏡檢法對(duì)成囊前期幼蟲的檢出率分別為50％(4/8)和89％(8/9),感染后16~21天檢出率均為100％

10、;感染后14~21天,貝氏法的檢出率均為100％;感染后14~21天,ELISA檢測(cè)的小鼠血清抗體陽性率分別為12.5％(1/8)、11.1％(1/9)、11.1％(1/9)、25％(2/8)、22.2％(2/9)、22.2％(2/9)、40％(4/10)及40％(4/10)。感染后14天鏡檢法和貝氏法對(duì)成囊前期幼蟲的檢出率有顯著性差異(X2=5.333,P<0.05);感染后15天兩者的檢出率無顯著性差異(9/9)(X2=1.059,

11、P>0.05)。旋毛蟲感染后18天及21天,ELISA的陽性率均明顯低于鏡檢法和貝氏法(X2=18.9,P<0.05;X2=18.9,P<0.05)。4.不同日齡成囊前期幼蟲對(duì)小鼠的感染性8~11日齡成囊前期幼蟲經(jīng)喂飼膈肌和灌胃接種小鼠后42天,剖殺小鼠全身肌肉消化后均未檢獲幼蟲,表明11日齡之前的幼蟲無感染性。含12~15日齡幼蟲膈肌分別喂飼9、9、10、10只小鼠,42天后小鼠的感染成功率均為100％,每只小鼠平均檢獲幼蟲數(shù)分別為1

12、01.38±110.45、367.43±728.32、15448.67±6178.35及27433.30±11733.24;12~15日齡幼蟲分別灌胃接種10只小鼠,42天后小鼠的感染成功率分別為33％(3/10)、33％(3/10)、40％(4/10)及40％(4/10),檢獲的幼蟲數(shù)分別為5、6、12及92條。12、13日齡幼蟲喂飼膈肌和灌胃2種方法的感染成功率之間有顯著性差異(X2=9.975,P<0.05),14、15日齡兩種感

13、染方法陽性率亦有顯著差異(X2=10.769,P<0.05)。結(jié)果表明12日齡幼蟲開始具有感染性,且幼蟲日齡與喂飼膈肌感染小鼠后檢獲的蟲數(shù)呈相關(guān)性(r=0.939,P<0.05),幼蟲日齡與灌胃接種小鼠后的感染成功率亦呈相關(guān)性(r=0.926,P<0.05),表明旋毛蟲成囊前期幼蟲的感染性隨著日齡延長(zhǎng)而增加。含11~13日齡幼蟲的小鼠肌肉消化30min的幼蟲存活率分別為6.9％(16/231)、54.6％(136/249)及67.2％(

14、199/296),60min的幼蟲存活率分別為43.4％(148/341)、57.3％(142/248)及89.6％(267/298),240min的幼蟲存活率分別為6.4％(20/314)、25.1％(77/307)、58.1％(462/795)。含11~13日齡幼蟲的小鼠肌肉消化30、60及240min的幼蟲存活率之間均有顯著性差異(X230min=203.50,X260min=149.78,X2240min=286.24,P<0.

15、05)。表明肌肉消化后幼蟲的存活率隨幼蟲日齡的延長(zhǎng)而增加。5.小鼠感染旋毛蟲后不同時(shí)間血清抗體水平觀察小鼠感染旋毛蟲后11天開始檢出血清抗體,陽性率為8％(1/12),此后抗體陽性率逐漸增高,至感染后24天陽性率達(dá)100％;感染后11~28天的血清吸光度(A492)之間有顯著性差異(F=10.731,P<0.05)。
　　結(jié)論：1.旋毛蟲河南株和云南株肌幼蟲對(duì)冰凍的抵抗力較弱,兩者經(jīng)-18℃分別保存12h和24h已無感染性。鄉(xiāng)土旋