胰島素缺乏對阿爾茨海墨病轉基因小鼠腦內神經病理改變的影響及機制研究.pdf

1、前言：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種發(fā)生于老年期或老年前期的慢性進行性神經退行性疾病,該疾病是以記憶力逐漸減退、認知障礙為突出表現(xiàn),同時伴有精神行為異常、人格障礙等臨床癥狀。AD的主要病理特征是腦內淀粉樣蛋白沉積形成的老年斑(senile plaque,SP)和神經元內出現(xiàn)神經原纖維纏結(neurofibrillary tangles,NFTs)。NFTs是神經元內tau蛋白的過度磷酸化所致。老年斑的

2、核心成分是一種由39～43個氨基酸殘基構成的小神經肽—Aβ(β-amyloidpeptide),Aβ是淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)的裂解產物。腦內APP代謝有兩條途徑,一條是非Aβ生成途徑,另一條是Aβ生成途徑。非Aβ生成途徑是α-分泌酶在α位點將APP水解成sAPPα和C83兩個片段,C83接著被γ-分泌酶生成P3片段,不形成Aβ;另一條途徑是APP被β-和γ-分泌酶連續(xù)裂解從而產生sA

3、PPβ和Aβ。
　　 胰島素是由胰島B細胞分泌的一種蛋白質類激素,其主要功能是降低血糖。近年來的研究發(fā)現(xiàn)腦內存在胰島素和胰島素受體(insulin receptor,IR)。腦內的胰島素可以由外周血中胰島素通過血腦屏障入腦,同時腦內的部分神經元也能夠合成和分泌胰島素。腦內胰島素在血糖的調節(jié)、食物的攝入和體重的調節(jié)等過程中都發(fā)揮著重要的作用。胰島素可以通過胰島素信號轉導通路影響認知功能。胰島素及胰島素信號通路調節(jié)的異常在AD發(fā)病和

4、進展中起重要作用。流行病學資料顯示,與正常人群相比,AD患者腦脊液中胰島素水平明顯下降,并伴有腦內胰島素信號轉導通路障礙;伴有胰島素水平降低的AD患者更容易出現(xiàn)認知功能異常。向AD轉基因鼠腦內注射鏈脲佐菌素(streptozotozin,STZ),可影響腦內胰島素受體功能,導致AD癥狀加重和漸進性認知功能損害,再向實驗鼠腦內注射胰島素后,動物的認知功能明顯恢復。采用經鼻腔胰島素治療方法,能改善早期AD及遺忘型輕度認知功能障礙患者的認知功

5、能。更有趣的是,一些臨床研究發(fā)現(xiàn),對于糖尿病患者如果早期進行胰島素治療,發(fā)展為AD的風險會大大降低。另外,有研究發(fā)現(xiàn)STZ誘導的胰島素缺乏可以增高小鼠腦內Aβ和磷酸化tau蛋白的表達,表明胰島素缺乏參與Aβ的沉積和tau蛋白的異常磷酸化。但目前關于胰島素缺乏影響AD發(fā)病的機制研究尚不十分清楚。
　　 為了驗證胰島素缺乏在AD發(fā)病中可能的作用及機制,本實驗選用APP/PS1轉基因AD小鼠腹腔內注射STZ,應用行為學、形態(tài)學和分子生

6、物學等手段,探討胰島素缺乏影響AD發(fā)病的證據(jù)及機制。同時采用過表達人APPsw基因的SH-SY5Y細胞,體外給予不同濃度的胰島素,觀察APP代謝和磷酸化tau蛋白的表達,進一步探討胰島素缺乏在AD發(fā)病中的作用。本項目的實施有望將胰島素通路作為預防和治療AD的新靶點,為有效的延緩或阻抑Aβ沉積和tau蛋白異常磷酸化奠定實驗基礎。
　　 方法：
　　 1、胰島素缺乏對APP/PS1轉基因小鼠腦內神經病理改變和認知功能影響及其

7、機制的研究采用3月齡APP/PS1轉基因小鼠,腹腔內注射STZ,誘導產生胰島素缺乏的AD小鼠動物模型。應用Morris水迷宮檢測AD小鼠的行為學變化;應用免疫組織化學技術檢測AD小鼠腦組織老年斑的分布;應用PCR技術檢測AD小鼠腦內APP mRNA的表達;應用ELISA對AD小鼠腦內Aβ含量進行定量分析;應用Western blotting技術檢測AD小鼠腦內tau蛋白的磷酸化、APP代謝及胰島素信號轉導系統(tǒng)相關蛋白的表達。
　　

8、 2、胰島素對高表達人APPsw的SH-SY5Y細胞內APP代謝及tau蛋白磷酸化的影響及其機制的研究采用高表達人APPsw的SH-SY5Y細胞,觀察胰島素對APP代謝的影響及機制研究。應用Westem blotting技術檢測APPsw細胞內tau蛋白的磷酸化、APP代謝及胰島素信號轉導系統(tǒng)相關蛋白的表達;應用免疫熒光雙標與共聚焦激光掃描顯微鏡檢測APPsw細胞內p-GSK-3和Aβ及p-tau的共表達。
　　 結果：

9、>　　 一、胰島素缺乏對APP/PS1小鼠腦內Aβ沉積、tau蛋白磷酸化及認知功能的影響
　　 1、胰島素缺乏對APP/PS1轉基因小鼠體重、血糖和胰島素含量的影響與正常對照組AD小鼠相比,STZ誘導的胰島素缺乏導致AD小鼠血糖升高、體重下降及胰島素水平下降。
　　 2、胰島素缺乏對APP/PS1轉基因小鼠腦內APP裂解酶及其裂解產物蛋白表達的影響Western blotting結果顯示:STZ誘導的胰島素缺乏使AD小

10、鼠腦內APP695蛋白水平明顯增高;STZ組BACE1、sAPPβ、CTFs蛋白表達明顯增多,而sAPPα表達下降。
　　 3、胰島素缺乏對APP/PS1轉基因小鼠腦內Aβ及老年斑的影響免疫組化和ELISA結果顯示:STZ誘導的胰島素缺乏使AD小鼠大腦皮層、海馬的老年斑塊的數(shù)量和體積明顯增多;STZ組Aβ1-42含量明顯增加。
　　 4、胰島素缺乏對APP/PS1轉基因小鼠腦內tau蛋白磷酸化的影響免疫組化和Wester

11、n blotting結果顯示:STZ誘導的胰島素缺乏使AD小鼠腦內Thr231和Ser396位點上的tau蛋白磷酸化表達水平增高。
　　 5、胰島素缺乏對APP/PS1轉基因小鼠學習記憶能力的影響Morris水迷宮結果顯示:STZ誘導的胰島素缺乏使AD小鼠的學習記憶能力和空間探索能力均顯著降低。
　　 二、胰島素缺乏加劇APP/PS1小鼠腦內神經病理改變的分子生物學機制
　　 1、胰島素缺乏對APP/PS1轉基因

12、小鼠腦內胰島素受體(IR)磷酸化的影響Western blotting結果顯示:STZ誘導的胰島素缺乏使AD小鼠腦內p-IR/IR比值明顯下降。
　　 2、胰島素缺乏對APP/PS1轉基因小鼠腦內GSK-3蛋白活性的影響Western blotting結果顯示:STZ誘導的胰島素缺乏使AD小鼠腦內p-GSK-3α/GSK-3α和p-GSK-3β/GSK-3β的比值明顯下降。
　　 3、胰島素缺乏對APP/PS1轉基因小鼠

13、腦內MAPK蛋白活性的影響Western blotting結果顯示:STZ誘導的胰島素缺乏使AD小鼠腦內p-JNK1/JNK1和p-JNK2/JNK2的比值明顯增高,而p-ERK/ERK和p-P38/P38的比值沒有明顯變化。
　　 三、胰島素對轉染APPsw細胞內APP代謝及tau蛋白磷酸化的影響
　　 1、胰島素對APPsw細胞內GSK-3和JNK蛋白活性的影響Western blotting結果顯示:不同濃度胰島素

14、使APPsw細胞p-GSK-3α/GSK-3α和p-GSK-3β/GSK-3β的比值逐漸增高;而胰島素對P-JNK/JNK比值沒有明顯影響。
　　 2、胰島素對APPsw細胞內APP裂解產物蛋白表達的影響Western blotting和免疫熒光雙標結果顯示:100 nM和1000 nM的胰島素使APPsw細胞內sAPPα蛋白表達明顯增多,CTFs蛋白表達下降。Ap和p-GSK-3主要分布于細胞質中,而且在APPsw細胞中二者的

15、表達有一定關系。
　　 3、胰島素對APPsw細胞內tau蛋白磷酸化的影響Western blotting結果顯示:1000 nM的胰島素使APPsw細胞內Thr231和Ser396位點上的tau蛋白磷酸化表達水平降低。P-tau和p-GSK-3主要分布于細胞質中,而且在APPsw細胞中二者的表達有一定關系。
　　 結論：
　　 1、STZ誘導的胰島素缺乏可加劇APP/PS1轉基因小鼠腦內Aβ沉積、tau蛋白異常