四種不同種屬鼠的皮膚黑色素分布及α-MSH表達(dá)研究.pdf

1、一、目的與意義： 色素代謝障礙性疾病(如黃褐斑、白癜風(fēng))，發(fā)病率高，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，臨床缺乏理想療效的關(guān)鍵是有關(guān)色素調(diào)節(jié)的影響因素、作用機(jī)理與規(guī)律未能得到深入的科學(xué)闡述；而動物實驗則是醫(yī)學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)與條件，實驗動物更是醫(yī)學(xué)研究的重要載體和手段。當(dāng)前國內(nèi)外不少學(xué)者已展開對色素代謝障礙性疾病動物實驗的研究，但大多數(shù)報道的是某一疾病動物模型的建造方法或藥物對酪氨酸酶活性與黑素細(xì)胞增殖或抑制作用的影響，而不同觀察指標(biāo)與適宜實驗動物

2、的選擇問題及更深入的研究還是欠缺。 事實上，由于實驗動物的種屬、品系等的不同，其解剖、生理、病理、遺傳傾向及實驗敏感性等生物學(xué)特性亦有所差異，會對動物實驗的成功與否具有不同程度的影響。究竟哪種動物是色素代謝實驗?zāi)Ｐ偷睦硐脒x擇，依據(jù)是什么? 目前研究認(rèn)為，色素代謝障礙性疾病主要是皮膚黑素代謝障礙所引起的，而黑素主要由黑素細(xì)胞分泌。黑素細(xì)胞含有黑素生成酶(酪氨酸酶)，在酪氨酸酶的作用下，酪氨酸逐漸被氧化，接著重新排列并聚合，

3、最后與蛋白質(zhì)結(jié)合為黑素蛋白。因此，國內(nèi)外文獻(xiàn)研究多針對酪氨酸酶活性對黑素細(xì)胞增殖或抑制作用的影響。最近研究證實，表皮細(xì)胞中黑素細(xì)胞能產(chǎn)生和分解阿黑皮素原，生成a-黑素細(xì)胞刺激素(a-melanocyte-stimulatinghormone，a-MSH)，再與黑皮素-1(MC1R)受體結(jié)合，激活腺甘酸環(huán)化酶，提高細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)水平，進(jìn)而激活cAMP倚賴蛋白激酶，促進(jìn)酪氨酸酶的合成及表達(dá)，促進(jìn)黑素細(xì)胞有絲分裂，使黑素細(xì)胞快速

4、增值，促進(jìn)黑素合成。因此，a-MSH也對黑素生成具有重要意義。 為了能夠進(jìn)一步說明色素代謝障礙性疾病實驗研究的動物選擇問題，并能夠深入探討黑素細(xì)胞刺激素可能的影響機(jī)制，我們對SPF級雌性昆明種小白鼠、C57BL/6J小黑鼠、雌性白色FMN豚鼠及棕黃色HARTLY豚鼠四種常用于色素病實驗研究的動物進(jìn)行了有關(guān)皮膚表皮黑色素分布及a-MSH表達(dá)情況的對比觀察研究，以期為選擇合理的實驗動物及深入探討黑素細(xì)胞刺激素的影響機(jī)制提供必要的理論

5、和實驗依據(jù)。 二、方法與內(nèi)容： 購進(jìn)正常的SPF級雌性昆明種小白鼠、C57BL/6J小黑鼠、雌性白色FMN豚鼠及棕黃色HARTLY豚鼠各12只，各組小鼠預(yù)養(yǎng)3天，正常喂養(yǎng)1周后，于第8天上午將各組動物用3％戊巴比妥45mg/Kg腹腔麻醉后，作常規(guī)固定，刮除背部皮膚表面毛發(fā)，用組織剪剪取2cm×2cm大小皮膚數(shù)塊，10％中性甲醛固定，常規(guī)石蠟切片備用； 1、四種不同種屬鼠的皮膚表皮黑色素分布情況的觀察研究

6、隨機(jī)在每組選擇相同數(shù)量的標(biāo)本，脫蠟至水，抗原修復(fù)后，用MouseAnti-HumanMelanomaMonoclonalAntibody為第一抗體，以免疫組織化學(xué)方法(具體操作按相關(guān)試劑盒說明)顯示表皮中的黑色素顆粒，用緩沖液替代第一抗體做陰性對照，用已知陽性切片作為陽性對照，在200倍顯微鏡下觀察黑色素陽性細(xì)胞在表皮中的分布情況，并進(jìn)一步用Imagetools3.0圖像分析軟件分析細(xì)胞平均截面積和灰度值。 2、四種不同種屬鼠的

7、皮膚表皮a-MSH表達(dá)情況的觀察研究 隨機(jī)在每組選擇相同數(shù)量的標(biāo)本，脫蠟至水，抗原修復(fù)后，用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(S-P)常規(guī)染色法檢測a-MSH在表皮的陽性表達(dá)情況，用緩沖液替代第一抗體做陰性對照，用已知陽性切片作為陽性對照。然后將標(biāo)本均用200倍顯微鏡下隨機(jī)選擇20個視野觀察表皮a-MSH陽性細(xì)胞分布情況，并由JVC彩色攝像頭將細(xì)胞圖像輸入Mias系統(tǒng)拍照。 最后采用相應(yīng)的計分方法，分別對動物皮膚表皮表

8、皮黑色素及a-MSH陽性細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計計分，并應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，對實驗結(jié)果加以分析，均以a=0.05，P<0.05時判為有顯著性差異； 三、結(jié)果： 1、四種不同種屬鼠的皮膚表皮黑色素分布情況的觀察結(jié)果 在SPF級雌性昆明種小白鼠和雌性白色FMN豚鼠的表皮及毛囊中幾乎未見陽性表達(dá)的黑色素顆粒，C57BL/6J小黑鼠可見黑色素顆粒成簇分布于毛囊基底細(xì)胞團(tuán)中，在表皮中幾乎未見陽性表達(dá)的黑色素顆粒，棕黃色HAR

9、TLY豚鼠基底層細(xì)胞間及毛囊中均可見黑色素顆粒陽性反應(yīng)的黑素細(xì)胞，中間層的角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)有時可見少量被吞噬的淡染的黑色素顆粒存在；棕黃色HARTLY豚鼠陽性細(xì)胞數(shù)、截面積、灰度值均優(yōu)于其他三組動物(P<0.01)；C57BL/6J小黑鼠陽性細(xì)胞數(shù)、截面積、灰度值均優(yōu)兩組白色動物(P<0.01)；兩組白色動物陽性細(xì)胞數(shù)、截面積、灰度值均無明顯差異(P>0.05)。 2、四種不同種屬鼠的皮膚表皮a-MSH表達(dá)情況的觀察結(jié)果

10、在SPF級雌性昆明種小白鼠和雌性白色FMN豚鼠的表皮及毛囊中幾乎未見陽性表達(dá)的a-MSH細(xì)胞，陽性表達(dá)率均為0.00％，C57BL/6J小黑鼠可見a-MSH分布于毛囊基底細(xì)胞團(tuán)中，在表皮中幾乎未見陽性表達(dá)的a-MSH細(xì)胞，陽性表達(dá)率為20.00％，棕黃色HARTLY豚鼠基底層細(xì)胞間及毛囊中均可見陽性表達(dá)的a-MSH，在表皮黑素細(xì)胞的胞漿或細(xì)胞外基質(zhì)，為黃或棕黃色顆粒，呈局灶性或彌漫性分布陽性表達(dá)率為55.00％。且a-MSH在C57BL

11、/6J小黑鼠毛囊黑素細(xì)胞及棕黃色HARTLY豚鼠表皮黑素細(xì)胞的陽性表達(dá)有顯著性差異(P<0.01)。 四、結(jié)論： 1、白色昆明雌性小鼠及白色FMN雌性豚鼠不適宜用作觀測皮膚表皮及毛囊黑色素或a-MSH變化情況的實驗研究，可考慮用于色素增加性實驗?zāi)Ｐ图八幬锏难芯浚?2、C57BL/6J小黑鼠適宜用作色素代謝障礙性皮膚疾病的實驗動物，但僅適宜用于觀測毛囊a-MSH變化情況的實驗研究： 3、棕黃色HARTLY豚

12、鼠則適宜用做觀察皮膚表皮及毛囊的黑色素或a-MSH變化情況的實驗研究； 4、棕黃色HARTLY豚鼠的表皮及毛囊黑色素細(xì)胞分泌黑色素的能力優(yōu)于C57BL/6J小黑鼠的表皮及毛囊黑色素細(xì)胞，有統(tǒng)計學(xué)意義，因此棕黃色HARTLY豚鼠比C57BL/6J小黑鼠更適宜用于色素代謝障礙性皮膚疾病動物實驗研究； 5、本實驗提示我們，目前已初步具備了對a-MSH進(jìn)行研究的實驗條件，由于a-MSH在黑色素代謝過程中的調(diào)控作用較酪氨酸酶更為細(xì)