電針預(yù)處理通過CB1R上調(diào)TGF-β1發(fā)揮腦保護(hù)作用的研究.pdf

1、“隨著社會(huì)人口結(jié)構(gòu)老齡化問題日益嚴(yán)重,我國中風(fēng)發(fā)生率以每年8.7％的速度增長,其中缺血性卒中占80%。我國腦卒中發(fā)病率居世界第一,腦卒中已成為我國第一位死因和成年人首要的致殘病因,嚴(yán)重影響生活質(zhì)量,給患者及其家庭和社會(huì)帶來極大的精神及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1,2,3,4]。經(jīng)典的溶栓劑治療,即重組組織型纖溶酶元激活物(rtPA),因其治療時(shí)間窗短(中風(fēng)發(fā)生后3-4.5h),增加治療期間顱內(nèi)出血風(fēng)險(xiǎn),在臨床應(yīng)用受限,僅有約5%的中風(fēng)患者可以得到及時(shí)有

2、效的溶栓治療;另外對復(fù)發(fā)型及合并心血管疾病的中風(fēng)患者抗血小板治療需嚴(yán)格的適應(yīng)癥征和精確的用藥劑量防止更為嚴(yán)重的并發(fā)癥。因此,中風(fēng)的治療需要更加科學(xué)的策略,為中風(fēng)患者和家庭尋找更加有效的防治措施將成為今后研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)方向?！?br>　　“隨著對中風(fēng)病理機(jī)制的研究進(jìn)一步深入,現(xiàn)在認(rèn)識(shí)到:興奮性毒性、梗死周圍去極化、神經(jīng)炎癥和程序性細(xì)胞死亡各種導(dǎo)致缺血損傷的機(jī)制,由缺血引發(fā),在不同時(shí)相相互重疊緊密聯(lián)系。這種缺血級(jí)聯(lián)反應(yīng)在腦缺血發(fā)生后幾分鐘

3、內(nèi)引起不可逆的神經(jīng)元損傷,中樞系統(tǒng)神經(jīng)炎癥反應(yīng)參與了由血液供應(yīng)中斷而引發(fā)的急性腦血管事件的各個(gè)病理生理階段,不但導(dǎo)致腦缺血損傷并且參與了隨后的神經(jīng)組織修復(fù)的進(jìn)程。由此可見,神經(jīng)炎癥是腦卒中導(dǎo)致缺血再灌注損傷及神經(jīng)恢復(fù)的重要因素,研究腦缺血損傷的炎癥機(jī)制將是神經(jīng)保護(hù)研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。我們實(shí)驗(yàn)室之前的研究證實(shí)電針預(yù)處理可上調(diào)腦缺血再灌注后大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元α7nAChR表達(dá),顯著降低腦再灌注損傷后腦組織和血漿中促炎因子HMGB1水平,抑制神經(jīng)系

4、統(tǒng)炎癥產(chǎn)生腦保護(hù)作用,然而電針在神經(jīng)系統(tǒng)中的抗炎作用機(jī)制相關(guān)研究遠(yuǎn)未揭示,有待進(jìn)一步闡明。另外我們證實(shí)電針在缺血前和缺血發(fā)生后通過大麻素系統(tǒng)上調(diào)腦缺血周圍組織 CB1R受體激活內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制而發(fā)揮腦保護(hù)作用,而最新的體外實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)大麻素參與了神經(jīng)炎癥反應(yīng),有明顯的抗炎作用。內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)對炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制是目前的研究熱點(diǎn),然而其機(jī)制并不完全清楚,其與炎癥介質(zhì)和炎癥因子的交互作用是復(fù)雜而多向的?！?br>　　“轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF

5、-β)是具有多種功能的細(xì)胞因子,其在抑制神經(jīng)炎癥中的作用已被認(rèn)可,TGF-β在中樞神經(jīng)及某些外周器官的發(fā)育和形成過程中扮演重要角色,具有神經(jīng)保護(hù)作用。TGF-β可影響腦缺血后活化的小膠質(zhì)細(xì)胞的功能狀態(tài)發(fā)揮腦保護(hù)作用,各種腦損傷或疾病均可誘導(dǎo)TGF-β表達(dá),并表現(xiàn)出其神經(jīng)保護(hù)作用。在中樞內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)與TGF-β交互作用于小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。由此,本研究一方面著眼于TGF-β可能是電針腦保護(hù)機(jī)制的重要組成部分,另一方面明確內(nèi)源

6、性大麻素系統(tǒng)與TGF-β的關(guān)系,為臨床治療中風(fēng)提供更加充分的理論依據(jù)及新的手段和靶點(diǎn)。”
　　實(shí)驗(yàn)一:電針預(yù)處理對腦缺血后TGF-β1表達(dá)的影響
　　目的:觀察電針預(yù)處理對缺血再灌注后大鼠腦組織半暗帶TGF-β1表達(dá)變化的影響。
　　方法:
　　1.電針的腦保護(hù)作用
　　見以往的電針腦保護(hù)研究。
　　2.在腦缺血再灌注損傷后半暗區(qū)TGF-β1的表達(dá)變化及電針對TGF-β1表達(dá)影響雄性SD大鼠根據(jù)缺血再

7、灌注損傷后時(shí)間點(diǎn)不同隨機(jī)分為8組(n=6):假手術(shù)組(Sham)、再灌注后2h、4h、6h、12h、24h、48h及72h,在各時(shí)間點(diǎn)將動(dòng)物處死取腦并切取半暗帶,提取組織蛋白,Western Blot檢測不同時(shí)間點(diǎn)TGF-β1的表達(dá)情況。
　　雄性SD大鼠分組同I,再灌注24h后處死動(dòng)物(n=6),運(yùn)用western blot觀察該時(shí)間點(diǎn)各組TGF-β1的表達(dá)情況
　　3.電針刺激對半暗區(qū)神經(jīng)元TGF-β1表達(dá)量的影響

8、>　　雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組(n=4),拔除線栓再灌注24h,將動(dòng)物處死,多聚甲醛灌流固定腦組織,冰凍組織切片后進(jìn)行免疫熒光染色。同時(shí)將TGF-β1與神經(jīng)元的標(biāo)記物NeuN進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)染色。
　　結(jié)果:
　　Western blot結(jié)果顯示,再灌注損傷發(fā)生后6h,缺血再灌注組TGF-β1表達(dá)量較Sham組顯著上調(diào)(P<0.05),其中以24小時(shí)表達(dá)量較高。缺血再灌后24小時(shí),與I/R組相比,EA組半暗帶組織中的TGF-

9、β1含量明顯增高(P<0.05)。使用TGF-β1和神經(jīng)元的標(biāo)記物 NeuN雙標(biāo)記,其結(jié)果顯示電針預(yù)處理腦缺血再灌注損傷后24h TGF-β1表達(dá)在神經(jīng)元細(xì)胞上明顯增多。
　　結(jié)論:
　　缺血再灌注后腦缺血周圍組織TGF-β1表達(dá)增高,電針預(yù)處理可進(jìn)一步上調(diào)其表達(dá)發(fā)揮腦保護(hù)作用,電針預(yù)處理可在缺血后24小時(shí)上調(diào)神經(jīng)元TGF-β1表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)二:TGF-β1在電針腦保護(hù)中的作用研究
　　目的:觀察下調(diào)TGF-β

10、1表達(dá)對電針保護(hù)作用的影響及外源性 TGF-β1的對腦缺血再灌注損傷的影響
　　方法:
　　雄性SD大鼠,隨機(jī)分為6組(n=8):Sham組、I/R組、EA組和EA+TGF-β1干擾RNA組、EA+MAB240(TGF-β1中和抗體)組、I/R+重組TGF-β1。缺血前48h側(cè)腦室注射TGF-β1干擾RNA(25nmol);缺血前0.5h,側(cè)腦室注射MAB240(TGF-β1中和抗體)(0.4 mg/kg),重組TGF-β1

11、(0.8 ug/Kg),容量均為10ul。動(dòng)物經(jīng)歷2h缺血后于再灌注72h處死,進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分和腦梗死容積測定。
　　結(jié)果:
　　再灌注72h,EA組腦梗死容積較I/R組顯著降低(P<0.05),并且神經(jīng)行為學(xué)評分較I/R組有所改善(P<0.05)。EA+siRNA和EA+MAB240與EA組相比梗死面積顯著增加(P<0.05),而I/R+重組TGF-β1組與I/R組相比腦梗死容積明顯減少(P<0.05),產(chǎn)生了與電針預(yù)

12、處理相似的作用。與EA組相比,EA+siRNA組和EA+MB240行為學(xué)評分明顯降低(P<0.05),與I/R組相比外源性給予重組TGF-β1可顯著改善大鼠腦缺血再灌注后72小時(shí)的神經(jīng)行為學(xué)評分(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　下調(diào)TGF-β1的表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)電針預(yù)處理的腦保護(hù)作用,而外源性TGF-β1可模擬電針的腦缺血耐受作用
　　實(shí)驗(yàn)三:TGF-β1在電針預(yù)處理抗凋亡中的作用研究
　　目的:進(jìn)一步觀察TGF-

13、β1對電針預(yù)處理腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　方法:
　　1.TGF-β1對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響
　　雄性SD大鼠,用隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分為5組(n=4):Sham組、I/R組、EA組、EA+TGFβ-siRNA組及I/R+重組TGF-β1組。缺血前48h,進(jìn)行TGF-β1-siRNA(25nmol)側(cè)腦室注射,缺血前0.5h重組TGF-β1(0.8 ug/Kg)側(cè)腦室注射,容量均為10ul。動(dòng)

14、物經(jīng)歷2h缺血后于再灌注后24h處死,灌流后制作石蠟切片,進(jìn)行TUNEL染色,觀察各組切片神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量的變化。
　　2.TGF-β1對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　雄性SD大鼠隨機(jī)分為分5組(n=6):Sham組、I/R組、EA組、EA+siRNA組和I/R+rhTGF-β1組。于再灌注24h處死取缺血半暗帶,通過western blot對Bcl-2和Bax進(jìn)行蛋白定量分析,觀察對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響。
　　結(jié)果

15、:
　　EA組中 TUNEL陽性細(xì)胞的數(shù)量較I/R組(P<0.01)顯著減少,EA+siRNA組較EA組顯著增多(P<0.01)。I/R組Bax/Bcl-2的比率較Sham組升高(P<0.05)。EA組Bax/Bcl-2的比率較I/R組則顯著下調(diào)(P<0.05)。電針預(yù)處理組給予TGF-β1-siRNA側(cè)腦室注射則可以顯著下調(diào) Bcl-2的表達(dá)并上調(diào) Bax的表達(dá)而增加兩者的比值(P<0.05)。而I/R組予以側(cè)腦室注射重組TGF

16、-β1可顯著降低兩者比值(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　下調(diào)TGF-β1能夠增加大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,拮抗電針預(yù)處理的腦保護(hù)作用,而重組的TGF-β1減輕缺血后神經(jīng)系統(tǒng)的損傷,產(chǎn)生擬電針樣腦保護(hù)作用,說明TGF-β1通過對抗凋亡,在電針腦保護(hù)作用中發(fā)揮了重要的作用。
　　實(shí)驗(yàn)四電針通過大麻素CB1調(diào)控TGF-β1表達(dá)的研究
　　目的觀察電針預(yù)處理對腦缺血再灌注損傷后大麻素對TGF-β1的表達(dá)的

17、影響
　　方法
　　1.CB1受體拮抗劑對電針預(yù)處理后TGF-β1表達(dá)的影響
　　雄性SD大鼠,隨機(jī)分為4組(n=6):I/R組、EA+I/R組、EA+AM251(SR141716A)組和EA+DMSO組。電針預(yù)處理2h后制作腦缺血模型,制作模型前0.5h腹膜內(nèi)注射AM251(SR141716A),劑量為1mg/kg(1.5mg/kg),于再灌注損傷后24h處死取皮層半暗帶,Western Blot測定半暗帶TGF-β

18、1表達(dá)含量。
　　2.CB1受體的干擾RNA對電針預(yù)處理后TGF-β1表達(dá)的影響
　　雄性SD大鼠,分組同前:I/R組、EA+I/R組、EA+CB1R-siRNA組和EA+Vehicle組。電針預(yù)處理2h后制作腦缺血模型,制作模型前48h側(cè)腦室內(nèi)注射CB1R-siRNA(10μg/10μl),于再灌注損傷后24h處死取皮層半暗帶,Western Blot測定半暗帶TGF-β1表達(dá)含量。
　　3.CB1受體激動(dòng)劑ACEA

19、對電針預(yù)處理后TGF-β1表達(dá)的影響
　　雄性SD大鼠,隨機(jī)分為3組(n=6):I/R組、I/R+ACEA組和I/R+Vehicle組。制作模型前0.5h腹膜內(nèi)注射ACEA,劑量為2.5 mg/kg,于再灌注損傷后24h處死取皮層半暗帶,Western Blot測定半暗帶TGF-β1表達(dá)含量。
　　結(jié)果
　　再灌注后24h測得 EA+AM251組半暗帶 TGF-β1的相對表達(dá)含量較 EA組和EA+DMSO組顯著降低(P

20、<0.05);EA+SR141716A組半暗帶TGF-β1的相對表達(dá)含量較EA組和EA+DMSO組顯著降低(P<0.05);EA+CB1-siRNA組TGF-β1表達(dá)量較EA組EA+Vehicle組顯著降低(P<0.05);I/R+ACEA組TGF-β1表達(dá)相對含量較I/R組和I/R+vehicle組顯著上調(diào)(P<0.05)。
　　結(jié)論
　　電針預(yù)處理的同時(shí)給予CB1受體的拮抗劑AM251、SR141716A和CB1受體的干

21、擾RNA,抑制CB1受體的生物活性,發(fā)現(xiàn)兩類藥物能夠逆轉(zhuǎn)電針預(yù)處理后TGF-β1表達(dá)的上調(diào);與之相反現(xiàn)象的是,實(shí)驗(yàn)中給予CB1受體的受體激動(dòng)劑ACEA,則能夠模擬電針預(yù)處理后TGF-β1表達(dá)的上調(diào),提示電針預(yù)處理可通過上游CB1受體調(diào)節(jié)TGF-β1的表達(dá)發(fā)揮腦保護(hù)作用。
　　小結(jié)
　　1.電針預(yù)處理可以改善腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)行為學(xué)評分和腦梗死容積,增加缺血半暗帶TGF-β1的表達(dá)。
　　2.抑制TGF-β1分子可以