電針預(yù)處理通過調(diào)節(jié)CB2R-EAAT2產(chǎn)生腦缺血耐受作用.pdf

1、腦缺血損傷時(shí),組織會(huì)釋放大量游離的興奮性氨基酸,主要是谷氨酸,它們作用于突觸后膜的谷氨酸受體N-methyl-D-aspartate(NMDA),使其過度激活,通過谷氨酸受體依賴的離子通道開放引起鈣超載,導(dǎo)致神經(jīng)元發(fā)生壞死或凋亡,加重繼發(fā)性腦損傷。由于神經(jīng)元內(nèi)缺乏可降解谷氨酸的酶類,所以谷氨酸的清除主要是依靠神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞膜上的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。谷氨酸被神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞膜上的興奮性谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(EAATs)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi),在谷氨酰胺合成酶

2、的作用下轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺,后者再被轉(zhuǎn)運(yùn)回神經(jīng)元內(nèi)[1]。EAATs分為EAAT1-5型,其中EAAT2在皮層和紋狀體較豐富,且僅表達(dá)于膠質(zhì)細(xì)胞。腦缺血損傷時(shí),谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的90％由EAAT2完成,是最主要的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體[2]。大鼠腦卒中后給予電針治療,可以顯著增加EAAT2的表達(dá)水平,增強(qiáng)谷氨酸的重?cái)z取功能,產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用[3]。我們前期研究發(fā)現(xiàn),電針(Electroacupuncture,EA)預(yù)處理可以激活大鼠腦缺血組織中CB2受體

3、發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[4]。據(jù)報(bào)道,小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞均有CB2受體表達(dá)[5]。同時(shí),本課題組前期試驗(yàn)利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),發(fā)現(xiàn)給予CB2受體激動(dòng)劑AM1241預(yù)處理可以減輕脂多糖(LPS)和γ-干擾素(IFN-γ)引起的小膠質(zhì)細(xì)胞活化和損傷作用[6];同時(shí)也可以減輕由谷氨酸介導(dǎo)引起的小膠質(zhì)細(xì)胞活化和損傷作用[7]。
　　電針預(yù)處理產(chǎn)生的神經(jīng)保護(hù)作用已明確與CB2受體相關(guān)。與此同時(shí),電針治療作用又與調(diào)節(jié)谷氨酸攝取和降解有關(guān),但目前關(guān)

4、于電針預(yù)處理激活CB2受體后如何發(fā)揮作用還不清楚,因此,我們推測(cè)電針預(yù)處理激活CB2受體可能作用于EAAT2發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)利用C57BL/6小鼠全腦缺血損傷模型,對(duì)此假說進(jìn)行驗(yàn)證。
　　實(shí)驗(yàn)一EAAT2在電針預(yù)處理誘導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)的研究目的:
　　驗(yàn)證電針預(yù)處理作用,觀察EAAT2是否參與電針預(yù)處理誘導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　方法:
　　成年雄性C57BL/6小鼠64只,隨機(jī)分為8組(n=8):假手術(shù)組(Sh

5、am組)、對(duì)照組(Con組)、頭孢曲松鈉組(CeftriaxoneSodium,CXT組)、溶劑組(V組)、電針預(yù)處理組(EA組)、Dihydrokainate+電針組(DHK+EA組)、DHK溶劑+電針組(V+EA組)和DHK組。CXT組術(shù)前連續(xù)5d腹腔注射CXT600mg/kg,V組給予等容量CXT溶劑生理鹽水0.1mL,DHK組缺血前1h側(cè)腦室單次注射DHK200ug/kg;EA組、DHK+EA和V+EA組麻醉后接受電針刺激“百會(huì)

6、穴”,選用疏密波、頻率2/15Hz、電流強(qiáng)度1mA,30min/天,連續(xù)5天。除Sham組外,各組動(dòng)物處理完成后24h用雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻塞(BCCAO)方法制備小鼠全腦缺血再灌注損傷模型,缺血20min。DHK+EA組和V+EA組分別于缺血前1h側(cè)腦室注射DHK200ug/kg或等容量溶劑生理鹽水2uL。各組動(dòng)物再灌注24h后行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分,然后處死,取腦組織,HE染色,光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),進(jìn)行海馬CA1區(qū)損傷神經(jīng)元計(jì)數(shù)。
　　結(jié)

7、果:
　　1.EAAT2激動(dòng)劑CXT預(yù)處理可以減輕C57BL/6小鼠的全腦缺血損傷
　　小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和海馬CA1區(qū)組織病理學(xué)結(jié)果:與Sham組比較,Con組小鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分顯著降低(P<0.05),損傷神經(jīng)元數(shù)目增多(P<0.05);與Con組比較,CXT組可明顯增加神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分(P<0.05),減少損傷神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目(P<0.05),V組神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分和損傷的神經(jīng)元數(shù)目沒有變化(P>0.05)。
　　2.E

8、AAT2拮抗劑DHK可以逆轉(zhuǎn)電針預(yù)處理產(chǎn)生的腦缺血耐受作用
　　小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和CA1區(qū)組織病理學(xué)結(jié)果:與Sham組比較,Con組神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分顯著降低(P<0.05),損傷神經(jīng)元數(shù)目增多(P<0.05);與Con組比較,EA組和V+EA組可明顯提高神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分(P<0.05),降低損傷神經(jīng)元的數(shù)目(P<0.05);與EA組比較,DHK+EA組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯降低(P<0.05),損傷神經(jīng)元數(shù)目增加(P<0.05),但V+

9、EA組與EA組比較,的神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分沒有改變和損傷神經(jīng)元數(shù)目也沒有差異(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　電針預(yù)處理可改善腦缺血損傷作用,提高小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和降低損傷神經(jīng)元的數(shù)目。腦缺血前給予EAAT2的拮抗劑DHK可以明顯逆轉(zhuǎn)電針預(yù)處理的神經(jīng)保護(hù)作用。而EAAT2激動(dòng)劑CXT預(yù)處理也可增加全腦缺血模型小鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和降低損傷神經(jīng)元的數(shù)目,提示EAAT2參與了電針預(yù)處理誘導(dǎo)產(chǎn)生的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　實(shí)驗(yàn)二CB

10、2R/EAAT2在電針預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受作用的研究目的:
　　驗(yàn)證CB2參與電針預(yù)處理產(chǎn)生的腦缺血耐受作用,進(jìn)一步探討電針預(yù)處理激活CB2受體后是否調(diào)節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞膜上的EAAT2發(fā)揮腦缺血耐受作用。
　　方法:
　　成年雄性C57BL/6小鼠136只,隨機(jī)分為11組:Sham組、Con組、EA組、AM630+EA組、溶劑+電針組(V+EA組)、AM1241組、溶劑組(V組)、ACEA組、AM251+EA組、AM630組

11、和AM251組。AM1241組、ACEA組、V組、AM630組和AM251組分別于缺血前連續(xù)5d腹腔注射AM1241、ACEA或等容量溶劑,AM6303mg/kg和AM2511mg/kg;EA組、AM630+EA組、AM251+EA組和V+EA組麻醉后接受電針刺激“百會(huì)穴”,參數(shù)同實(shí)驗(yàn)一,并于電針前3h和30min分別腹腔注射AM251和AM630及其溶劑。處理完成后24h制備小鼠全腦缺血再灌注損傷模型,缺血20min。每組各取6只采用

12、Westernblotting方法檢測(cè)EAAT2蛋白表達(dá)。另外Sham組、Con組、EA組、AM630+EA組、V+EA組和AM630組各取14只:每組8只再灌注24h神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分后處死小鼠,取腦組織,HE染色,光鏡下計(jì)數(shù)海馬CA1區(qū)損傷神經(jīng)元數(shù)目;每組6只,再灌注24h利用免疫熒光法檢測(cè)EAAT2和星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物-膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(GFAP)共標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)目。
　　結(jié)果:
　　1.CB2受體拮抗劑AM63

13、0逆轉(zhuǎn)電針預(yù)處理的神經(jīng)保護(hù)作用
　　小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和CA1區(qū)組織病理學(xué)結(jié)果:與Sham組比較,Con組小鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分顯著降低(P<0.05),損傷的神經(jīng)元數(shù)目也明顯增多(P<0.05);與Con組比較,EA組和V+EA組小鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯增加(P<0.05),損傷的神經(jīng)元數(shù)目減少(P<0.05);與EA組比較,AM630+EA組小鼠神經(jīng)行為評(píng)分降低(P<0.05),損傷神經(jīng)元數(shù)目也明顯增多(P<0.05),而V+EA組

14、這兩項(xiàng)指標(biāo)沒有差異(P>0.05)。2.CB2受體激動(dòng)劑AM1241預(yù)處理上調(diào)腦缺血組織EAAT2蛋白表達(dá),CB2受體拮抗劑AM630逆轉(zhuǎn)電針預(yù)處理的上調(diào)EAAT2蛋白表達(dá)作用
　　Westernblotting結(jié)果:與Sham組比較,Con組EAAT2表達(dá)雖有所升高,但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與Con組比較,EA組和V+EA組EAAT2的蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05);與EA組比較,AM630+EA組EAAT2蛋白

15、表達(dá)水平下降(P<0.05),而V+EA組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。與Con組比較,AM1241組EAAT2表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05),V組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　3.電針預(yù)處理上調(diào)腦缺血區(qū)GFAP和EAAT2蛋白表達(dá)水平,CB2受體拮抗劑AM630可以逆轉(zhuǎn)此作用
　　免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果和Westernblotting結(jié)果一致。Sham組和全腦缺血再灌注24h的Con組都表達(dá)EAAT2,兩組之間沒

16、有顯著性差異;電針預(yù)處理后EAAT2的表達(dá)明顯多于Con組,AM630+EA組弱于EA組。Sham組和Con組GFAP強(qiáng)度沒有差異,EA組GFAP明顯強(qiáng)于Con組和AM630+EA組。EAAT2-GFAP雙標(biāo)記的陽性細(xì)胞,同樣也是EA組明顯強(qiáng)于Con組,而AM630+EA組減弱。
　　4.CB1受體激動(dòng)劑ACEA預(yù)處理對(duì)全腦缺血EAAT2蛋白表達(dá)水平?jīng)]有影響,CB1受體拮抗劑AM251也未逆轉(zhuǎn)電針預(yù)處理引起的EAAT2蛋白表達(dá)上調(diào)

17、。
　　Westernblotting結(jié)果:與Sham組比較,Con組EAAT2表達(dá)雖有所升高,但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與Con組比較,EA組和V+EA組EAAT2的蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05);與EA組比較,AM251+EA組EAAT2蛋白水平雖有所下調(diào),但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),V+EA組同樣(P>0.05)。與Con組比較,ACEA組和V組的EAAT2蛋白表達(dá)水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)

18、>　　結(jié)論:
　　1.神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分和病理組織學(xué)結(jié)果證明:CB2受體拮抗劑AM630可以逆轉(zhuǎn)電針預(yù)處理的神經(jīng)保護(hù)作用;Westernblotting和免疫熒光結(jié)果顯示:AM630逆轉(zhuǎn)了電針預(yù)處理引起EAAT2-GFAP陽性細(xì)胞數(shù)的增多,CB2受體激動(dòng)劑AM1241預(yù)處理也上調(diào)EAAT2蛋白表達(dá)水平,提示電針預(yù)處理是通過CB2R/EAAT2發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的。
　　2.CB1受體未參與電針預(yù)處理對(duì)EAAT2蛋白表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。