電針預處理通過CB1R調(diào)控神經(jīng)元GluR2誘導腦缺血耐受作用的研究.pdf

1、腦卒中是導致人類死亡與殘疾最重要的病因之一,其主要的病理生理學改變是嚴重的組織缺血損傷。腦組織遭遇缺血損傷時,神經(jīng)元突觸前膜會迅速釋放大量的興奮性氨基酸--谷氨酸,谷氨酸的堆積又使突觸后膜谷氨酸受體過度激活,引發(fā)嚴重的興奮毒性,造成神經(jīng)元死亡。過量的谷氨酸主要激活突觸后膜上2種谷氨酸受體:α-氨基-3羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸鹽受體(α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionate r

2、eceptor,AMPAR)和天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)。大量研究證實AMPAR廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng),但其表達有明顯的區(qū)域性差別,海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元表達最高,表明AMPAR與全腦缺血后海馬組織的特異性神經(jīng)元死亡有著更加密切的關系。AMPAR是由GluR1-GluR4四種亞基圍繞一個親水中心孔道組合而成的五聚體結(jié)構(gòu),其中GluR2決定了AMPAR的鈣離子通透性。全腦缺血損傷

3、后,GluR2蛋白表達下調(diào),使得大量鈣離子經(jīng)過通透性已改變的AMPAR進入相對脆弱的海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元,使胞內(nèi)鈣超載,引發(fā)一系列致死反應,造成神經(jīng)元死亡。許多學者曾利用AMPAR拮抗劑治療缺血性腦損傷,然而都因阻斷AMPAR過度激活的同時也破壞了AMPAR正常生理功能,均以失敗告終。然而因AMPAR GluR2亞基具有獨特的調(diào)節(jié)鈣離子通透性的作用,故該亞基可能成為針對AMPAR治療腦缺血損傷的新靶點。
　　有學者在爪蟾卵母細胞

4、中發(fā)現(xiàn),內(nèi)源性大麻素花生四烯酸乙醇胺(anandamide,AEA)可以直接與AMPAR作用,抑制AMPAR的亞基重組,這提示了內(nèi)源性大麻素與谷氨酸受體有著一定的關系。另有細胞實驗發(fā)現(xiàn)激活神經(jīng)元AMPAR,可引起內(nèi)源性大麻素AEA及2-花生酰基甘油(2-arachidonoylglycerol,2-AG)合成增加,減弱興奮毒性對神經(jīng)元造成的損傷;而應用減弱內(nèi)源性大麻素消耗的攝取抑制劑UCM707,可通過激活大麻素Ⅰ型受體(cannabi

5、noid receptor1,CB1R)與大麻素Ⅱ型受體(cannabinoid receptor2,CB2R),抵抗興奮毒性損傷。此外,有在體研究報道,紅藻氨酸誘導的興奮毒性使得野生型小鼠海馬組織中內(nèi)源性大麻素的含量迅速上調(diào),從而保護小鼠海馬神經(jīng)元免受興奮毒性損傷;而在CB1R基因敲除小鼠腦內(nèi),該保護作用消失。還有動物實驗發(fā)現(xiàn),給予CB1激動劑WIN55212-2,可以減少突觸前膜谷氨酸的釋放,而CB1R抑制劑SR141716A抵消該

6、作用,這表明內(nèi)源性大麻素可通過CB1R抑制谷氨酸能的突觸傳遞。這一系列結(jié)果說明,由AMPAR過度激活誘導的興奮毒性可以應激性的使內(nèi)源性大麻素合成增加,抵抗興奮毒性,從而保護神經(jīng)元,而這一作用與CB1R關系密切。
　　我實驗室前期研究證實在動物百會穴給予缺血前電針預處理,可以激活內(nèi)源性大麻素系統(tǒng),上調(diào)內(nèi)源性大麻素配體AEA與2-AG,通過激活的大麻素受體發(fā)揮神經(jīng)保護作用。但是電針預處理誘導腦缺血耐受的機制仍需進一步探索。
　　

7、基于以上背景,本實驗利用C57BL/6小鼠短暫全腦缺血模型,觀察電針預處理是否通過CB1R調(diào)節(jié)GluR2,發(fā)揮缺血后腦保護作用,以求進一步完善電針預處理誘導腦缺血耐受的機制,并且為針對AMPAR治療腦中風帶來新的視角與契機。
　　實驗一:電針預處理對全腦缺血損傷后海馬GluR2表達的影響
　　目的:全腦缺血損傷后,海馬神經(jīng)元GluR2蛋白表達下降,引起胞內(nèi)鈣超載,造成神經(jīng)元死亡。本實驗預觀察電針預處理是否可影響全腦缺血后海馬

8、神經(jīng)元GluR2的蛋白表達。
　　方法:
　　1.全腦缺血再灌后不同時間點海馬神經(jīng)元GluR2的表達水平
　　成年雄性C57小鼠30只(18-22g),隨機分為2組:假手術組(Sham)、模型組(I/R),小鼠缺血再灌后2h、6h、24h、48h、72 h將動物處死取腦,利用Western blotting,測定不同時間點海馬神經(jīng)元GluR2的蛋白表達水平。
　　2.電針預處理對缺血后海馬神經(jīng)元GluR2表達的影

9、響
　　成年雄性C57小鼠20只隨機分為4組:假手術組(Sham)、缺血組(Con)、電針(EA)預處理組(EA+GCI)、單純電針組(EA)。小鼠缺血再灌后2h處死取腦及冰凍切片,運用Western blotting及免疫熒光染色測定海馬神經(jīng)元GluR2的蛋白表達變化。
　　結(jié)果:
　　1.短暫全腦缺血再灌注后2h,海馬區(qū)GluR2表達明顯減少。
　　Western blotting顯示,與Sham組比較,I/

10、R組2h可見GluR2在海馬組織的表達明顯降低(P<0.05),其他時間點組間蛋白表達量無統(tǒng)計學差異。
　　2.電針預處理有效上調(diào)短暫性全腦缺血損傷后海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元上GluR2蛋白的表達。
　　Western blotting結(jié)果顯示,與Con組比較,EA+GCI組海馬組織中GluR2蛋白表達明顯上調(diào)(P<0.05),Sham組和EA組無統(tǒng)計學差異。免疫熒光雙標染色結(jié)果顯示,GluR2主要表達于海馬CA1區(qū)錐體細胞膜

11、。
　　結(jié)論:全腦缺血再灌注2h,海馬組織GluR2蛋白表達明顯降低;電針預處理可上調(diào)全腦缺血后海馬神經(jīng)元GluR2的蛋白表達。
　　實驗二:海馬GluR2參與電針預處理誘導腦保護作用的研究
　　目的:實驗一證實電針預處理可上調(diào)缺血后海馬組織GluR2的蛋白表達,但該亞基的蛋白表達變化是否影響電針預處理腦保護作用不得而知。本實驗探索海馬組織GluR2是否參與電針預處理腦保護作用。
　　方法:
　　1.Glu

12、R2siRNA干涉海馬神經(jīng)元GluR2表達的效果驗證
　　成年雄性 C57小鼠15只隨機分為3組:空白對照組(Sham)、siRNA干涉組(siRNA)、亂序?qū)φ战M(scRNA)。海馬定位注射后,72h后取腦,行Western blotting檢測海馬神經(jīng)元GluR2表達變化。
　　2.干涉GluR2表達對電針預處理腦保護作用的影響
　　成年雄性C57小鼠20只隨機分為4組:假手術組(Sham)、缺血組(Con)、電針

13、處理組(EA+GCI)、GluR2干涉+電針組(siRNA+ EA+GCI)。小鼠缺血再灌后24h行神經(jīng)功能學評分和灌注石蠟切片。評估各組小鼠神經(jīng)功能,并行TUNEL染色和Nissl染色測定海馬神經(jīng)元凋亡及存活數(shù)目。
　　3.GluR2對缺血損傷后神經(jīng)細胞凋亡蛋白的影響
　　成年雄性C57小鼠20只隨機分為4組:假手術組(Sham)、缺血組(Con)、電針處理組(EA+GCI)、GluR2干涉+電針組(siRNA+EA+GC

14、I)。動物經(jīng)歷缺血再灌注后24h處死取腦,運用Western blotting對凋亡蛋白Bcl-2和Bax表達進行定量分析。
　　結(jié)果:
　　1.干涉海馬組織GluR2蛋白表達可逆轉(zhuǎn)電針預誘導的腦保護作用。
　　海馬定位注射GluR2 siRNA72h后,siRNA組海馬組織中GluR2蛋白表達顯著低于Sham組與scRNA組(P<0.05),表明海馬組織GluR2的蛋白表達被抑制。
　　小鼠全腦缺血再灌后24h

15、,EA+GCI組小鼠的神經(jīng)功能學評分明顯優(yōu)于 Con組(P<0.05),而與EA+GCI組比較,siRNA+ EA+GCI組神經(jīng)功能學評分復又下降(P<0.05)。這表明抑制GluR2表達可逆轉(zhuǎn)電針預處理對神經(jīng)功能的改善作用。
　　小鼠全腦缺血再灌后24h,尼氏染色結(jié)果顯示,EA+GCI組的神經(jīng)元存活數(shù)目遠大于Con組(P<0.05),siRNA+EA+GCI組存活神經(jīng)元數(shù)目明顯低于 EA+GCI組(P<0.05)。這表明抑制Gl

16、uR2表達可逆轉(zhuǎn)電針預處理抑制神經(jīng)元死亡的作用。
　　2.海馬神經(jīng)元GluR2分子通過減少缺血損傷后神經(jīng)元凋亡參與電針預處理腦保護作用。
　　小鼠全腦缺血再灌后24h,TUNEL結(jié)果顯示,與Con組比較,EA+GCI組TUNEL陽性細胞數(shù)減少(P<0.05),干涉掉GluR2后,缺血再灌注損傷組織中TUNEL陽性細胞數(shù)量又明顯增加(P<0.05)。Western blotting結(jié)果顯示,Con組凋亡蛋白Bax/Bcl-2比

17、例較 Sham組明顯升高,EA+GCI組該比例顯著下降(P<0.05),siRNA+ EA+GCI組則又上調(diào)該比例(P<0.05)。
　　結(jié)論:上調(diào)海馬神經(jīng)元 GluR2的表達,可通過抑制缺血后神經(jīng)元凋亡,參與電針預處理誘導的腦缺血耐受作用。
　　實驗三:內(nèi)源性大麻素2-AG預處理對腦缺血損傷后GluR2表達水平的影響
　　目的:以上實驗證實電針預處理可上調(diào)全腦缺血后海馬神經(jīng)元GluR2蛋白表達發(fā)揮腦保護作用,但電針預

18、處理通過何種機制影響GluR2的表達尚不清楚。我們以前的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)是電針預處理腦保護作用的重要機制之一。故本實驗欲觀察內(nèi)源性大麻素是否參與調(diào)控電針對海馬神經(jīng)元GluR2的影響。
　　方法:
　　2-AG預處理對海馬神經(jīng)元GluR2表達的影響及其可能機制
　　成年雄性C57小鼠20只隨機分為4組:假手術組(Sham)、缺血組(Con)、2-AG處理組(2-AG)、2-AG+CB1受體抑制劑(AM251)組(

19、AM251+2-AG)、溶劑組(V)。小鼠缺血再灌后2h處死取腦。運用Western blotting測定海馬神經(jīng)元GluR2的表達水平變化。
　　結(jié)果:
　　2-AG預處理可上調(diào)缺血損傷后GluR2的表達,而AM251可逆轉(zhuǎn)這一作用。
　　Western blotting顯示,與Con組比較,2-AG組GluR2在海馬組織的表達明顯升高(P<0.05);與2-AG組比較,AM251+2-AG組GluR2在海馬組織的表

20、達復又降低(P<0.05),V組和Sham組之間無統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)論:內(nèi)源性大麻素2-AG可上調(diào)海馬神經(jīng)元GluR2的蛋白表達,而大麻素受體CB1R可能是其介導分子,故電針預處理是通過內(nèi)源性大麻素而影響GluR2的表達。
　　實驗四:CB1R對電針預處理上調(diào)腦缺血后海馬神經(jīng)元GluR2蛋白表達的調(diào)控作用
　　目的:前三步實驗表明電針預處理通過內(nèi)源性大麻素影響缺血后GluR2的蛋白表達,但其具體調(diào)控機制仍不清楚。本實

21、驗探索電針預處理后 CB1R對缺血后海馬神經(jīng)元GluR2蛋白表達的影響。
　　方法:
　　1.CB1受體激動劑ACEA和WIN55212-2對缺血后海馬神經(jīng)元GluR2表達的影響
　　成年雄性C57小鼠25只隨機分為5組:缺血組(Con)、電針處理組(EA+GCI)、CB1受體激動劑 ACEA組(ACEA+GCI)、CB1受體激動劑 WIN55212-2組(WIN55212-2+GCI)、溶劑組(V+GCI)。小鼠缺血

22、再灌后2h處死取腦,行Western blotting檢測GluR2表達變化。
　　2.CB1受體拮抗劑AM251和SR141716A對缺血后海馬神經(jīng)元GluR2表達的影響
　　成年雄性C57小鼠25只隨機分為5組:缺血組(Con)、電針處理組(EA+GCI)、CB1受體拮抗劑 AM251組(AM251+EA+GCI)、CB1受體拮抗劑 SR141716A組(SR141716A+EA+GCI)、溶劑組(V+EA+GCI)。小

23、鼠缺血再灌后2h處死取腦,行Western blotting檢測GluR2表達變化。
　　結(jié)果:
　　1.CB1受體激動劑可模擬電針預處理對全腦缺血損傷后海馬神經(jīng)元GluR2分子的上調(diào)作用。
　　Western blotting結(jié)果顯示，與Con組比較，CB1受體激動劑ACEA和WIN55212-2也可上調(diào)全腦缺血再灌后2h海馬神經(jīng)元GluR2的蛋白表達水平((P<0.05)。 V+GCI和Con組之間無統(tǒng)計學差異。<

24、br>　　2.CB1受體拮抗劑可逆轉(zhuǎn)電針預處理上調(diào)全腦缺血損傷后海馬神經(jīng)元GluR2蛋白表達的作用。
　　Western blotting結(jié)果顯示，與EA+GCI組比較，AM251+EA+GCI組和SR141716A+EA+GCI組海馬組織GluR2表達明顯下降(P<0.05)。EA+GCI和V+EA+GCI組之間無統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)論:電針預處理通過CB1R影響缺血后海馬神經(jīng)元GluR2的蛋白表達。
　　總結(jié):