分泌組學研究方法的優(yōu)化及其在癌癥研究中的應用.pdf

1、癌癥嚴重威脅著人們的生命健康。對于癌癥患者而言，能否在癌癥早期得到診斷、癌癥是否轉移、治療是否有效是影響其治療效果和生存率的重要因素。分泌蛋白在癌癥的早期階段、轉移和治療耐受中都發(fā)揮著極為重要的作用。開展相關的癌癥分泌組學研究，系統(tǒng)篩查相關的分泌蛋白，有利于發(fā)現(xiàn)新的治療靶點以及新型血清生物標志物。本論文建立和優(yōu)化了系列分泌組學的研究方法，并緊緊圍繞上述影響癌癥患者治療效果和生存率的重要因素，開展了相關的分泌組學研究。
　　首先，本

2、論文優(yōu)化了基于細胞培養(yǎng)的分泌組學研究的實驗方法，建立了對分泌蛋白質組進行高效鑒定的一維凝膠電泳與液相色譜—串聯(lián)質譜相結合的技術路線(GeLC-MS/MS)，并將該技術應用于鑒定和分析人乳腺癌MCF-7細胞及其多柔比星耐受細胞MCF-7/Dox的差異分泌蛋白質組，以系統(tǒng)篩查與乳腺癌多柔比星耐藥相關的分泌蛋白。通過基于肽段譜圖計數的非標記定量方法，我們篩查到了89個在MCF-7細胞和MCF-7/Dox細胞間差異表達的分泌蛋白，其中57個是首

3、次被報道與乳腺癌多柔比星耐藥相關。在這57個蛋白質中，有13個已被報道與癌癥轉移相關，是潛在的在癌癥轉移和化療耐受中發(fā)揮雙重作用的分泌蛋白，非常有希望成為新的有效的治療靶點。我們進一步驗證了其中的IL-18與乳腺癌耐受多柔比星的相關性。實驗結果顯示，IL-18的表達量在耐受多柔比星的細胞系和乳腺癌組織中顯著上調;癌細胞在有或無IL-18的情況下，對多柔比星的耐受能力顯著變化。這些研究結果表明，IL-18除了在乳腺癌轉移中具有作用，也在癌

4、細胞耐藥中發(fā)揮重要作用，是一個新發(fā)現(xiàn)的具有雙重作用的分泌蛋白。同時，在開展乳腺癌耐藥分泌組學研究的過程中，我們結合數據分析的需要，建立了一套分泌組學研究中常規(guī)使用的數據分析方法，如蛋白質亞細胞定位分析方法和基于肽段譜圖計數的非標記定量方法，從而在實驗室全面完善了分泌組學研究的實驗技術與數據分析方法，形成了一套完整的分泌組學研究方法。
　　接著，本論文將凝集素親和捕獲技術引入到基于細胞培養(yǎng)的分泌組學研究中，建立了有效降低胞內蛋白污染

5、、提高分泌蛋白鑒定效率的方法。在前面開展分泌組學研究時，我們遇到了和其他研究者一樣的問題，即:因不可避免的細胞死亡而釋放的大量胞內蛋白顯著掩蓋了含量甚微的分泌蛋白的檢測。在本論文的研究工作中，我們首次將凝集素親和捕獲技術應用于富集細胞（MCF-10A和MDA-MB-231）無血清培養(yǎng)液中的分泌蛋白。實驗結果顯示，經凝集素捕獲后，在MCF-10A細胞和MDA-MB-231細胞中，分泌蛋白的檢出數量分別從183增加至292、從194增加至3

6、68，并且鑒定到的在MCF-10A細胞和MDA-MB-231細胞間差異表達的分泌蛋白數量顯著增加。這些實驗結果說明，凝集素親和捕獲技術能有效的富集分泌蛋白并顯著提高分泌蛋白的檢出數量，有利于對分泌蛋白質組進行更全面、更詳盡的比較和分析，為更好的進行分泌蛋白質組的分析和比較奠定了基礎。
　　最后，在凝集素親和捕獲技術的基礎上，使得我們有能力開展基于新鮮組織培養(yǎng)的癌癥分泌組學研究，在更貼近生理狀態(tài)的情況下研究腫瘤組織的分泌組學。我們收

7、集了9對配對的早期結直腸癌和遠端正常組織的無血清培養(yǎng)液，利用凝集素親和捕獲技術富集了其中的分泌蛋白，進一步利用GeLC-MS/MS技術鑒定了捕獲到的蛋白質。通過采用基于肽段譜圖計數的非標記定量方法，我們篩查到了123個在結直腸癌組織和正常組織中顯著差異表達的分泌蛋白，其中68個在癌組織中表達量顯著上調。我們對其中的一個蛋白質，EFEMP2，采用多種實驗技術（免疫印跡、免疫組化、免疫酶聯(lián)反應）在組織水平和血清水平進行了詳盡的后期驗證工作。

8、實驗結果顯示，EFEMP2在結直腸癌患者的癌組織和血清中的表達量顯著上調，包括結直腸癌早期患者;此外，受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic，ROC)分析結果顯示，EFEMP2和目前臨床上使用的輔助結直腸癌診斷的生物標志物CEA的ROC曲線下面積分別為0.923和0.728，說明EFEMP2用于結直腸癌診斷的準確性顯著優(yōu)于CEA。上述實驗結果都說明，EFEMP2是非常有潛力的結直腸癌早期診

9、斷的血清生物標志物。
　　總的來說，在本論文的研究工作中，我們首先優(yōu)化了基于細胞培養(yǎng)的分泌組學研究方法，并將其運用于乳腺癌耐受多柔比星相關分泌蛋白的研究中，找到了一系列在化療耐受和癌癥轉移中發(fā)揮雙重作用的分泌蛋白。在此基礎上，我們在細胞系水平建立了基于凝集素親和捕獲的分泌組學研究方法，顯著提高了分泌蛋白的檢出效率和檢出數量。之后，我們進一步將該方法運用于基于新鮮組織培養(yǎng)的結直腸癌分泌組學研究，找到了一系列有潛力成為結直腸癌早期診斷