MALDI質(zhì)譜新方法與新技術(shù)及其在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用研究.pdf

1、本博士學(xué)位論文工作的主要集中于基于基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)的新方法新技術(shù)新發(fā)展及其在在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用研究。在痕量多肽富集除鹽的研究方面取得了創(chuàng)新性的進(jìn)展,利用嵌段共聚物成功實(shí)現(xiàn)了樣品高效靶上原位除鹽與富集后直接用于MALDI-TOFMS分析,并成功應(yīng)用到實(shí)際樣品小鼠肝臟的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中。在蛋白質(zhì)直接靶上酶解技術(shù)方面,發(fā)展了以樹(shù)枝狀聚合物-碳納米管為基體,將胰蛋白酶固定在樹(shù)枝狀聚合物的表面得到可溶性

2、的固定化酶,成功實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)在靶板上快速酶解后直接用于MALDI-TOFMS分析,特別適用于低豐度蛋白質(zhì)的高效酶解和質(zhì)譜鑒定。在基質(zhì)方面開(kāi)展了針對(duì)磷酸化多肽、寡聚糖和磷脂離子化效率低等問(wèn)題的研究工作,對(duì)基質(zhì)體系進(jìn)行研究,大大提高了上述三類(lèi)分子的離子化效率,為質(zhì)譜高靈敏度檢測(cè)提供了解決方案。在MALDI-TOFMS用于非小細(xì)胞組織切片直接分析開(kāi)展了研究工作,建立了用組織成像的方法尋找非小細(xì)胞癌生物標(biāo)志物的方法,發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺鱗癌中發(fā)現(xiàn)有

3、別于癌旁組織的m/z3000-3500的簇峰;發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞2種亞型肺鱗癌和肺腺癌相比,有各自特征性的磷脂分子峰出現(xiàn);發(fā)現(xiàn)癌組織中hemeb(m/z616.2)表達(dá)量遠(yuǎn)低于癌旁組織,成為區(qū)別非小細(xì)胞肺癌和癌旁組織的生物標(biāo)志物。隨著人類(lèi)基因組序列“全書(shū)”的繪制完成,首次在分子層面上為人類(lèi)揭示生命奧秘提供了一份生命“解剖圖”。此后,人類(lèi)對(duì)生命“密碼”的解讀大大加快了,進(jìn)入了后基因組時(shí)代中。蛋白質(zhì)組學(xué)(Proteomics)研究正是生命科學(xué)進(jìn)入

4、后基因組時(shí)代的標(biāo)志之一。蛋白質(zhì)組學(xué)以蛋白質(zhì)組(Proteome)為研究對(duì)象。蛋白質(zhì)組最初是指“由一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)組織的基因組所表達(dá)的全部相應(yīng)的蛋白質(zhì)”。測(cè)定一個(gè)有機(jī)體的基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)的設(shè)想,萌發(fā)在1975年雙向凝膠電泳發(fā)明之時(shí)。1994年Williams正式提出了這個(gè)問(wèn)題,而“蛋白質(zhì)組”的名詞則是由Wilkins創(chuàng)造的,它是由蛋白質(zhì)的“Protein”和基因組的“Ome”字母拼接而成,發(fā)表在1995年7月的Electrophor

5、esis雜志上。現(xiàn)在這一概念得到了擴(kuò)展,指有機(jī)體全部基因表達(dá)的全部蛋白質(zhì)及其存在方式,或者說(shuō)是一種細(xì)胞、組織或完整生物體在特定時(shí)空上所擁有的全套蛋白質(zhì),以及蛋白質(zhì)表達(dá)后的修飾,蛋白質(zhì)之間的相互作用,蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和更高級(jí)的復(fù)合物等。蛋白質(zhì)分離技術(shù)、蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)、蛋白質(zhì)相互作用分析及生物信息學(xué)數(shù)據(jù)處理技術(shù)被稱(chēng)為蛋白質(zhì)組研究的四大基本支撐技術(shù)。其中,在蛋白質(zhì)鑒定方面,質(zhì)譜技術(shù)是目前在鑒定蛋白質(zhì)的多種方法中發(fā)展最快、應(yīng)用最廣泛、最具發(fā)展?jié)?/p>

6、力的技術(shù)。自約翰.芬恩(JohnB.Ferm)和田中耕一(Koichi.Tanaka)分別發(fā)明了兩種重要的軟電離方式“電噴霧離子化(ESI)”和“基質(zhì)輔助激光解析離子化(MALDI)”技術(shù),建立對(duì)生物大分子進(jìn)行確認(rèn)和結(jié)構(gòu)分析的方法以來(lái),質(zhì)譜目前已經(jīng)成為生命科學(xué)領(lǐng)域最活躍的前沿研究領(lǐng)域之一。蛋白質(zhì)組學(xué)的科學(xué)研究之所以能夠取得蓬勃的發(fā)展,主要依賴(lài)于質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展以及高通量分離和分析技術(shù)的突破性進(jìn)步。然而,由于蛋白質(zhì)的可變性和多樣性等特點(diǎn)

7、,蛋白質(zhì)組研究在分析技術(shù)和分析儀器上還有很多瓶頸問(wèn)題有待解決。如蛋白質(zhì)的表達(dá)水平差異大,動(dòng)態(tài)范圍寬,現(xiàn)有的分離技術(shù)還不足以將一個(gè)生物體內(nèi)所有的蛋白質(zhì)分離開(kāi)來(lái):現(xiàn)有分析儀器的靈敏度還很難將體內(nèi)微量的蛋白質(zhì)精確分析,而這種微量蛋白在生命過(guò)程中起到關(guān)鍵性作用。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的進(jìn)一步深入,傳統(tǒng)的生物質(zhì)譜技術(shù)平臺(tái)已不足以應(yīng)對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)中高靈敏度高通量高準(zhǔn)確度等的檢測(cè)要求,所以研究和發(fā)展基于生物質(zhì)譜的新技術(shù)與新方法對(duì)于促進(jìn)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究顯得意

8、義重大。本論文以發(fā)展MALDI質(zhì)譜分析相關(guān)的新技術(shù)新方法為切入點(diǎn),開(kāi)展了相關(guān)研究工作。本論文共分為五章,主要內(nèi)容如下:第一章主要綜述了蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)展概況,包括蛋白質(zhì)組學(xué)的研究目的、意義、主要研究方法以及蛋白質(zhì)組學(xué)在人類(lèi)疾病研究中的應(yīng)用。質(zhì)譜儀器作為蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域中一個(gè)重要的技術(shù)支撐,本章節(jié)對(duì)質(zhì)譜儀器的發(fā)展?fàn)顩r進(jìn)行了簡(jiǎn)單的綜述,包括其核心部件離子源、質(zhì)量分析器和檢測(cè)器技術(shù)的發(fā)展?fàn)顩r。著重對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)中應(yīng)用廣泛的兩種質(zhì)譜儀器基質(zhì)輔助

9、激光解析質(zhì)譜和電噴霧質(zhì)譜的原理和應(yīng)用進(jìn)行了小結(jié)。本章還對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)分析時(shí)面臨的挑戰(zhàn)進(jìn)行了歸納,對(duì)MALDI技術(shù)研究的重要性和面臨的挑戰(zhàn)進(jìn)行分析,并在此基礎(chǔ)上提出了本課題工作的研究方向。第二章研究工作主要為嵌段共聚物PSF-b-PEO用于痕量多肽靶上除鹽和富集后直接MALDI-TOFMS分析的新方法研究。我們選擇微觀(guān)相分離結(jié)構(gòu)的嵌段共聚物PSF-b-PEO作為MALDI靶涂層,然后利用制作的聚合物涂層進(jìn)行痕量多肽的靶上除鹽和富集工作。嵌段

10、共聚物結(jié)構(gòu)中具有親水和疏水的兩端,在點(diǎn)覆樣品溶液后,由于疏水端不溶解在樣品溶劑中,保持嵌段聚合物在金屬上的膜穩(wěn)定性;親水端則可以溶解在樣品溶劑中并對(duì)鹽和一些污染物具有強(qiáng)的吸附作用,因而在樣品溶劑揮發(fā)的過(guò)程中,鹽和其它污染物被牢牢地包裹在聚合物內(nèi)部。點(diǎn)覆基質(zhì)溶液后,由于鹽被包裹在聚合物內(nèi)部,不再進(jìn)入到基質(zhì)的溶劑中,而肽段會(huì)再次溶解在基質(zhì)中并和基質(zhì)形成結(jié)晶。并且,由于聚合物膜的疏水性使得樣品會(huì)收縮在一個(gè)很小的靶點(diǎn)區(qū)域內(nèi),使樣品在靶上得到了富

11、集。因此無(wú)需額外清洗除鹽,富集除鹽后的樣品就可以直接進(jìn)行MALDI-TOFMS分析。第三章的研究工作主要為以樹(shù)枝狀聚合物-碳納米管為基體,將胰蛋白酶固定在樹(shù)枝狀聚合物的表面得到可溶性的固定化酶,成功實(shí)現(xiàn)了痕量蛋白質(zhì)在靶板上快速酶解后直接用于MALDI-TOFMS分析。我們首先在混合酸中對(duì)碳納米管進(jìn)行酸化處理在表面形成大量羧基并通過(guò)酸化處理截短碳納米管以及去除雜質(zhì)。然后將聚酰胺-胺型樹(shù)枝狀聚合物(dendrimers)通過(guò)共價(jià)結(jié)合的方式結(jié)

12、合在碳納米管表面,并將胰蛋白酶通過(guò)戊二醛交聯(lián)反應(yīng)固定在聚合物的氨基端。碳納米管表面修飾了dendrimers后,極大地增強(qiáng)了碳納米管的可溶性。因此,以樹(shù)枝狀聚合物-碳納米管為基體的固定化酶既具有固定化酶的穩(wěn)定性高的優(yōu)點(diǎn)又具有可溶性酶活性高的優(yōu)點(diǎn),并且由于它的可溶性,酶解后不需要將碳納米管從溶液中分離即可進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。以樹(shù)枝狀聚合物-碳納米管為基體的固定化胰蛋白酶進(jìn)行靶上酶解,效率高、速度快、酶自降解峰少,酶解完成后可以直接進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè),

13、特別適合痕量蛋白質(zhì)的酶解和鑒定。第四章研究工作主要為針對(duì)提高磷酸化多肽、寡聚糖及磷脂離子化效率開(kāi)展的MALDI基質(zhì)體系研究。通過(guò)在基質(zhì)溶液中添加磷酸銨鹽提高磷酸化肽的離子化效率;合成了新型離子基質(zhì)2,3,4-三羥基苯乙酮/N,N-二甲基苯胺(2,3,4-THAP/DMA),2,3,4-三羥基苯乙酮/吡啶(2,3,4-THAP/Py),2,4,6-三羥基苯乙酮/N,N-二甲基苯胺(2,4,6-THAP/DMA)和2,4,6-三羥基苯乙酮/

14、吡啶(2,4,6-THAP/Py)提高寡聚糖離子化效率;此外,還擴(kuò)展了非極性基質(zhì)[2E-3-(4-叔-丁基苯基)-2-甲基丙-2-亞烯基]丙二腈(DCTB)的應(yīng)用范圍,發(fā)現(xiàn)其在提高磷脂離子化效率方面有著重要的貢獻(xiàn)。大大提高了上述三類(lèi)分子的離子化效率,為質(zhì)譜高靈敏度檢測(cè)提供了解決方案第五章研究工作主要為MALDI質(zhì)譜成像技術(shù)用于非小細(xì)胞肺癌組織切片分析的研究。MALDI質(zhì)譜成像技術(shù)用于直接分析組織切片已在基礎(chǔ)與臨床醫(yī)學(xué)研究中迅速發(fā)展。通過(guò)

15、對(duì)冰凍組織切片表面的質(zhì)譜掃描可以快速直觀(guān)地得到組織中的分子如蛋白,多肽等的分布信息。我們采用質(zhì)譜成像技術(shù)對(duì)人的非小細(xì)胞肺癌組織切片及癌旁組織切片進(jìn)行了研究,對(duì)質(zhì)譜直接組織表面分析的方法進(jìn)行了優(yōu)化,初步建立了以質(zhì)譜成像法尋找非小細(xì)胞肺癌中的生物標(biāo)志物的方法。結(jié)果表明,肺鱗癌組織中有m/z3000-3500范圍內(nèi)的特征性簇峰出現(xiàn);發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞2種亞型肺鱗癌和肺腺癌相比,有各自特征性的磷脂分子峰出現(xiàn);以及在肺癌組織中hemeb表達(dá)量遠(yuǎn)低于癌旁