Neuropilin-1在膿毒癥小鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)免疫抑制功能的影響.pdf

1、研究目的:1.觀察不同盲腸結(jié)扎比例對(duì)小鼠脾臟調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cell，Treg，CD4+CD25+Treg)表面分子神經(jīng)纖毛蛋白-1(neuropilin-1)表達(dá)的影響。2觀察不同濃度抗neuropilin-1干預(yù)對(duì)細(xì)菌脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)刺激的Treg表面分子neuropilin-1、膜相關(guān)轉(zhuǎn)化性生長(zhǎng)因子-β(Transforming growth factor-β，TGF

2、-β)、T淋巴細(xì)胞毒性相關(guān)抗原-4(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)和特征性活性標(biāo)志物——又頭翼狀轉(zhuǎn)錄因子-3(Forkhead box-p3transcription factor, Foxp3)表達(dá)的影響。3.觀察不同濃度和不同時(shí)間抗neuropilin-1干預(yù)后的Treg對(duì)CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞增殖功能、細(xì)胞凋亡及轉(zhuǎn)錄因子Smad2表達(dá)與磷酸化的影響。

3、r>　　 研究方法:1.將60只雄性BALB/c小鼠按照盲腸結(jié)扎長(zhǎng)度在總盲腸中的比例分為輕度(結(jié)扎1/3)、中度(結(jié)扎1/2)和重度(結(jié)扎3/4)膿毒癥組，分別制作盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(Cecal ligation and puncture，CLP)膿毒癥模型;另外設(shè)置假傷組和對(duì)照組，每組各10只。分別于CLP24h后斷頸處死，取脾臟分離CD4+CD25+Treg，通過(guò)FACS Calibur流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞表面分子neuropili

4、n-1和特征性活性標(biāo)志物——Foxp3的表達(dá)。2.分選正常雄性BALB/c小鼠脾臟CD4+CD25+Treg后，分為正常細(xì)胞對(duì)照組、抗CD3/CD28組、不同濃度LPS(10、100、1000ng/ml)+抗CD3/CD28組;另外分離脾臟CD4+CD25+Treg后，分為對(duì)照組、抗CD3/CD28組、LPS(100ng/ml)+抗CD3/CD28組和LPS+抗CD3/CD28+不同濃度純化的抗小鼠/大鼠neuropilin-1組(0.

5、5、5、10μg/ml)，分別于培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞通過(guò)FACSCalibur流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞表面分子neuropilin-1、膜相關(guān)TGF-β、CTLA-4和Foxp-3表達(dá)。3.小鼠脾臟CD4+CD25+Treg分別用純化的抗小鼠/大鼠neuropilin-1(0.5、5、10μg/ml)預(yù)先封閉1h后，在抗CD3/CD28和LPS誘導(dǎo)下，分別按照細(xì)胞數(shù)比例為1∶1與CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng);并設(shè)正常CD4+CD25

6、+Treg和CD4+CD25T淋巴細(xì)胞對(duì)照組。分別培養(yǎng)12h、24h、48h后，通過(guò)Spectra MR全功能酶標(biāo)儀檢測(cè)CD4+CD25T淋巴細(xì)胞增殖功能、FACSCalibur流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)CD4+CD25T淋巴細(xì)胞凋亡和Western blot分析Smad2表達(dá)與磷酸化。
　　 研究結(jié)果:1與對(duì)照組和假傷組比較，CLP24h內(nèi)隨著盲腸結(jié)扎比例增加，生存率逐漸降低(P＜0.01); Foxp-3表達(dá)率隨著盲腸結(jié)扎比例的增加

7、逐漸升高，各組之間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與輕度膿毒癥組比較，中-重度膿毒癥組脾臟CD4+CD25+Treg表面分子neuropilin-1表達(dá)率明顯升高，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，中度膿毒癥組脾臟CD4+CD25+Treg表面分子neuropilin-1表達(dá)率已經(jīng)達(dá)到最高，與重度膿毒癥組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。2.與對(duì)照組或抗CD3/CD28組比較，小鼠脾臟CD4+CD25+Treg表面分子neuropi

8、lin-1、膜相關(guān)TGF-β、CTLA-4和Foxp-3表達(dá)隨著LPS濃度的增加，逐漸增強(qiáng)，其中中濃度LPS刺激已經(jīng)達(dá)到最大效能(P＜0.05或0.01);與LPS+抗CD3/CD28組比較，neuropilin-1和膜相關(guān)TGF-β表達(dá)隨著抗體濃度的升高，其表達(dá)率逐漸下降，各組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而抗neuropilin-1干預(yù)不能改變CD4+CD25+Treg表面分子CTLA-4和Foxp-3表達(dá)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.

9、05)。3.與對(duì)照組比較，抗CD3/CD28刺激12h后便能夠促進(jìn)小鼠脾臟CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;與LPS+抗CD3/CD28組比較，CD4+CD25+Treg和CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)12 h后，未經(jīng)抗neuropilin-1封閉的CD4+CD25+Treg便開(kāi)始抑制CD4+CD25-T細(xì)胞增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但隨著抗體濃度的增加，其抑制作用逐漸減弱，具有明顯的

10、濃度依賴性，其中5μg/ml組作用已經(jīng)最為明顯（P＜0.05）;與LPS+抗CD3/CD28組比較，CD4+CD25+Treg和CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)12 h后，未經(jīng)抗neuropilin-1封閉的CD4+CD25+Treg便開(kāi)始促進(jìn)CD4+CD25-T細(xì)胞凋亡，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而24h后，CD4+CD25-T細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步增加，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），同時(shí)CD4+CD25+Treg經(jīng)5μ

11、g/ml抗neuropilin-1封閉后能夠明顯抑制其促進(jìn)CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞凋亡的作用，凋亡率明顯降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);以β-actin作為內(nèi)參，Westem blot定性分析體內(nèi)實(shí)驗(yàn)各組脾臟 CD4+CD25T淋巴細(xì)胞內(nèi) Smad2和磷酸化-Smad2(Phospho-Smad2，P-Smad2)表達(dá)發(fā)現(xiàn):對(duì)照組、假傷組和輕度膿毒癥組Smad2和P-Smad2表達(dá)無(wú)明顯區(qū)別，而中-重度膿毒癥組Smad2

12、和P-Smad2表達(dá)量明顯增加;體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明未經(jīng)5μg/ml抗neuropilin-1封閉的CD4+CD25+Treg與CD4+CD25T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)48h后能夠明顯增加Smad2和P-Smad2的表達(dá)，同時(shí)經(jīng)5μg/ml抗neuropilin-1封閉后能夠逆轉(zhuǎn)這一作用。
　　 研究結(jié)論:1.盲腸不同結(jié)扎比例是膿毒癥小鼠死亡的危險(xiǎn)因素之一，Treg活性隨著盲腸結(jié)扎比例的增加逐漸增強(qiáng)，其細(xì)胞表面分子neuropilin-1