IL-37在人體外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞中的表達及其對免疫抑制功能的影響.pdf

1、目的:
　　1.證明白細胞介素-37(interleukin-37, IL-37)在人體外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells, Treg)中表達。
　　2.研究CD4+CD25+Treg活化程度與表達IL-37的時效關(guān)系。
　　3.證明IL-37的表達與CD4+CD25+Treg發(fā)揮免疫抑制效應有關(guān)。
　　方法:
　　第一部分:通過免疫磁珠分離技術(shù),分離健康志愿者外周血

2、中CD4+CD25+Treg細胞,應用流式細胞技術(shù)鑒定CD4+CD25+Treg細胞純度。
　　1.增殖活性檢測:設置刺激劑組(每1×105個CD4+CD25+Treg細胞加入20μl Dynabeads?Human Treg Expender)、非刺激劑組、空白對照組(無細胞組),通過CCK-8法檢測各組CD4+CD25+Treg細胞增殖活性,得出時效關(guān)系(24h、48h、72h)。
　　2.IL-37表達情況檢測:通過

3、Western blot技術(shù)檢測刺激劑作用下,不同時段(24h、48h、72h)IL-37表達水平的變化。
　　3.IL-37表達位置檢測:采用免疫熒光技術(shù)與激光共聚焦技術(shù)檢測IL-37在Treg細胞內(nèi)表達情況與表達位置。
　　第二部分:通過免疫磁珠分離技術(shù),分離健康志愿者外周血中CD4+CD25+Treg細胞和 CD4+T細胞。通過 siRNA技術(shù)沉默 Treg細胞 IL-37表達,分別設置siRNA-scramble干擾

4、后Treg細胞組、正常Treg細胞組、siRNA-IL37干擾后Treg細胞組。
　　1.SiRNA蛋白水平抑制效果檢測:采用Western blot技術(shù)檢測沉默效果。檢測 siRNA-scramble干擾后Treg細胞組、正常Treg細胞組、siRNA-IL37干擾后Treg細胞組在刺激劑作用72h時,IL-37表達情況。
　　2.增殖活性檢測:將CD4+CD25+Treg/CD4+CD25-T細胞共培養(yǎng)(按細胞計數(shù)1:1

5、比例),另設空白對照組(CD4+CD25-T細胞)。分別設siRNA-scramble干擾后Treg細胞組、正常 Treg細胞組、siRNA-IL37干擾后 Treg細胞組。每1×105個CD4+CD25+Treg細胞加入20μl Dynabeads?Human Treg Expender,采用CCK-8法檢測各組CD4+CD25+Treg對CD4+CD25-T細胞的抑制效應。
　　3.采用Elisa技術(shù),檢測不同時間CD4+CD

6、25+Treg/CD4+CD25-T細胞組,空白對照組上清液中IL-2、IFN-γ/IL-4、IL-10、TGF-β水平的變化。
　　結(jié)果:
　　1.健康志愿者外周血單個核細胞(PBMCs)經(jīng)過MACS兩次分選,應用流式細胞儀檢測得到CD4+CD25+Treg純度達93％,CD4+CD25+Treg使用臺盼藍染色檢測,細胞活性大于97%。
　　2.應用Dynabeads?Human Treg Expender對CD4+

7、CD25+Treg細胞刺激激活。采用CCK-8驗證其增殖效果良好,并在刺激達到72h時最為明顯。
　　3.通過Western blot檢測,CD4+CD25+Treg細胞表達IL-37;在Dynabeads?Human Treg Expender作用(24h、48h、72h),CD4+CD25+Treg表達IL-37水平增高(P<0.05)。
　　4.免疫熒光與激光共聚焦顯示,CD4+CD25+Treg表達IL-37,并且在

8、胞質(zhì)和細胞膜附近表達量較多。
　　5. CCK-8檢測T淋巴細胞增殖活性實驗中,SiRNA-IL-37干擾組與正常Treg共培養(yǎng)組、SiRNA-scramble干擾Treg組比較,OD450值存在明顯升高(P<0.01),表明siRNA-IL-37干擾組Treg對CD4+CD25-T細胞抑制效應下降;siRNA-IL-37干擾 Treg組與 CD4+CD25- T細胞對照組相比較,OD450值無明顯差異性(P>0.05),表明si

9、RNA-IL-37干擾組對CD4+CD25-T細胞抑制效應微弱,與對照組無差異。
　　6.流式細胞檢測SiRNA-IL-37干擾Treg組與正常Treg細胞組在刺激劑作用24h, Foxp3、CTLA-4表達情況,結(jié)果顯示SiRNA-IL-37干擾Treg組較正常組Foxp3、CTLA-4分子表達下降均明顯(P<0.05),說明CD4+CD25+Treg細胞內(nèi)IL-37的表達能夠明顯影響CTLA-4和Foxp3的表達,且兩者的表達

10、變化趨勢相同。
　　7.采用Elisa技術(shù),檢測正常CD4+CD25+Treg與siRNA-IL-37干擾CD4+CD25+Treg組細胞培養(yǎng)上清液中IL-10、TGF-β含量,結(jié)果表明siRNA干擾細胞兩因子含量均有明顯下降(P<0.01),表明CD4+CD25+Treg細胞IL-37的表達可能影響其抑制性細胞因子的生成。
　　8. siRNA-IL-37干擾Treg與CD4+CD25-T共培養(yǎng)組,72h檢測上清中IL-2

11、的濃度。檢測結(jié)果顯示,CD4+CD25-T細胞分泌IL-2,加入正常CD4+CD25+Treg細胞后IL-2濃度下降(P<0.01),但siRNA-IL-37干擾CD4+CD25+Treg細胞組IL-2分泌水平明顯上升(P<0.01)。陰性對照scramble干擾Treg組與CD4+CD25+Treg細胞組分泌情況無差異(P>0.05)。實驗中 IL-2由 T細胞分泌,干擾CD4+CD25+Treg細胞IL-37表達水平,共培養(yǎng)上清IL

12、-2濃度較正常對照組顯著增加,推斷IL-37在胞內(nèi)表達可能與Treg細胞抑制CD4+CD25-T細胞IL-2的分泌相關(guān)。
　　9. siRNA干擾 CD4+CD25+ TregIL-37表達后,其促進 Th2極化能力下降, IFN-γ/IL-4濃度比值上升,較正常對照組有統(tǒng)計學差異(P<0.01),效應 T細胞群向Th1趨勢極化。實驗結(jié)果顯示,干擾CD4+CD25+Treg表達IL-37,IFN-γ/IL-4顯著升高,因此,IL-

13、37蛋白在胞內(nèi)可能對 CD4+CD25+Treg介導的 Th2極化具有重要作用。
　　結(jié)論:
　　1.健康人體外周血 CD4+CD25+Treg能夠表達 IL-37,在新鮮提取的健康人CD4+CD25+Treg細胞中IL-37存在并少量表達。
　　2.隨著 CD4+CD25+Treg活化水平增高, IL-37表達水平逐漸升高,并在CD4+CD25+Treg細胞活性最強的72小時表達尤為明顯。IL-37在胞質(zhì)和細胞膜附近