膠質瘤干-祖細胞的細胞與分子生物學特征研究.pdf

1、本研究分為四部分： 第一部分、膠質瘤干/祖細胞長期培養(yǎng)及其特征分析 目的：以短期培養(yǎng)為主的人膠質瘤干/祖細胞（human Glioma Stem Cells/Progenitors，hGSCPs）研究進展迅速，但各家報告的生物學特征不盡一致，建立一個生物學特征相對穩(wěn)定盼永生化細胞系勢在必行，可為深入探討膠質瘤干/祖細胞生物學特征奠定基礎。 方法：將同一患者初發(fā)膠質瘤和復發(fā)的播散灶內的腫瘤組織制成單細胞，用CD13

2、3—免疫磁珠分選陽性細胞，在干細胞培養(yǎng)液中進行長期傳代培養(yǎng)和實時液氮凍存、復蘇后再培養(yǎng)。并根據無限增殖、多向分化等干細胞必備的指標進行鑒定。再用細胞擴增、分化走向、分子和細胞遺傳、致瘤性等指標觀察其生物學特征。 結果：從原發(fā)和復發(fā)的膠質瘤組織中分離得到的CD133+細胞，分別在體外連續(xù)培養(yǎng)了58個月和64個月，液氮凍存后復蘇仍能保持無限增殖和多向分化的特征不變。在無血清干細胞培養(yǎng)基中呈球狀生長，能擴增、少分化；在含血清培養(yǎng)基中培

3、養(yǎng)能分化成多形性瘤細胞，貼壁生長無接觸抑制。免疫共聚焦結果顯示：腫瘤球體中CD133+細胞占少數，Nestin+細胞占多數；貼壁分化細胞中Nestin+細胞占絕對多數，即使有GFAP+和β—TubulinⅢ+細胞出現，但都共表達Nestin。球體細胞、貼壁細胞的DNA和染色體顯帶都為異倍體。腫瘤球裸小鼠原位移植瘤原發(fā)為局部侵襲性生長，而復發(fā)者為播散性生長，并廣泛浸潤軟腦膜。 結論：建立了來自同一患者兩株能在體外長期傳代培養(yǎng)，保持

4、無限增殖、多向分化潛能不變的人膠質瘤干/祖細胞系，不僅有利于進一步研究膠質瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲的特性和機制，還為研究其播散性復發(fā)等機制奠定了基礎。 第二部分、原發(fā)和復發(fā)膠質瘤干/祖細胞在裸小鼠腦內移植瘤的特征 目的：人源膠質瘤干/祖細胞（human Glioma Stem Cells/ProgeIutors，hGSCPs）能分化成親本腫瘤細胞的全部亞型，在免疫缺陷動物腦內具有高致瘤性已得到公認，但其侵襲性與親本腫瘤的關系以

5、及GSCPs與移植瘤組織中血管細胞的關系尚未明確。本研究探討源自同一患者原發(fā)和復發(fā)腫瘤組織的GSCPs在裸小鼠顱內原位移植瘤的特征以及GSCPs移植瘤組織中的腫瘤細胞和血管內皮細胞的關系，旨在證明GSCPs裸小鼠原位移植瘤的侵襲性與親本腫瘤的關系和GSCPs在腦腫瘤組織重構中所起的作用。 方法：將已在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)的原發(fā)和復發(fā)hGSCPs球在立體定向儀輔助下接種到裸小鼠右腦尾狀核。實驗鼠出現惡病質時處死，取移植瘤組織常規(guī)石蠟包

6、埋、切片、HE、人類白細胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）和基質金屬蛋白酶—1（matrix metalloproteinase—1，MMP1）染色，觀察其致瘤率、侵襲性和血管來源細胞。 結果：所接種的40只裸小鼠在30天內全部因腫瘤而發(fā)病。無論是原發(fā)還是復發(fā)hGSCPS在裸小鼠腦內接種部位里浸潤性生長的同時，還散布于其它區(qū)域。但兩者的侵襲形式不盡相同，原發(fā)者在接種側半球，呈團塊，局限于腦實質；復發(fā)

7、者，還浸潤軟腦膜和對側半球，呈粟粒樣分布。MMP1+細胞的分布，復發(fā)者比原發(fā)者要密集得多。HLA染色顯示移植瘤中存在人源腫瘤細胞直接構成的血管。 結論：hGSCPs除了具有高致瘤性，還具有高侵襲性。復發(fā)的hGSCPs侵襲性更強，除了與MMP1高表達有關，還說明hGSCPs在侵襲性上具有親本腫瘤特異性。在hGSCPS的裸小鼠移植瘤中，腫瘤細胞在宿主腦內廣泛分布并構成了血管。GSCPs可能轉分化成腫瘤血管細胞，在腦膠質瘤組織重構中起

8、重要作用。 第三部分、克隆基因工程鼠的膠質瘤干/祖細胞和神經干/祖細胞 目的：據推測膠質瘤干/祖細胞（Glioma Stem Cells/Progenitors，GSCPs）源于神經干/祖細胞（Neural Stem Cells/ProgeIutors，NSCPs），但缺少實驗根據?？寺∫呀洶l(fā)生膠質瘤的基因工程鼠的GSCPs和NSCPs以及同品系胎鼠的NSCPs，旨在為進一步研究兩者淵源關系提供實驗用細胞。 方法

9、：取Tet—On小鼠位于小腦和大腦交界區(qū)域內的腫瘤組織和位于遠離腫瘤的側腦室室管膜下及其周圍盼正常腦組織，分別制成單細胞懸液，分別培養(yǎng)于無血清干細胞培養(yǎng)基和含血清培養(yǎng)基中。相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，電鏡觀察其超微結構，流式細胞儀檢測Hoechst33342陰性的SP細胞、細胞周期和染色體倍體，免疫熒光檢測球體及其分化細胞中的標志物表達情況。 結果：源于Tet—On鼠的腫瘤組織和室管膜區(qū)正常組織以及胎鼠腦組織細胞，在無血清培養(yǎng)基條件

10、下，呈懸浮的球體狀生長，并且表達Nstin；在含血清的培養(yǎng)條件下，貼壁分化成能表達膠質細胞和神經元標志蛋白的細胞。細胞球體在體外已傳代。電鏡結果顯示，GSCPs球體細胞具有核質比高、細胞器不發(fā)達的幼稚細胞特征。GSCPs球體中SP細胞比例為17.27%，NSCPs球體中SP細胞比例為2.48%，GSCPs球體中異倍體細胞比例為26，77%，NSCPs球體中異倍體細胞比例為0%。 結論：分別在Tet—On膠質瘤模型鼠中克隆到的GS

11、CPs和室管膜區(qū)域的NSCPs，都能在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)，為進一步研究兩者的細胞分子生物學關系奠定了基礎。 第四部分、膠質瘤千/祖細胞的分子信息分析 目的：已知膠質瘤干/祖細胞（Glioma Stem Cells/Progenitors，GSCPs）與神經干/祖細胞（Neural Stem Cells/ProgeIutors，NSCPs）在分子信號傳遞通路開通和關閉時程調控上存在差異，而這種差異有可能就是NSCPs突變成G

12、SCPs的分子原因。通過基因表達譜分析，篩選其差異分子，為進一步研究膠質瘤發(fā)生發(fā)展的分子病因奠定基礎。 方法：取Tet—On膠質瘤模型鼠的腫瘤組織中克隆到的GSCPs和室管膜區(qū)域的NSCPs以及來自于胎鼠胎腦的NSCPs，常規(guī)抽提和純化RNA，用Affymetrix Mouse Expression Array4302.0基因表達譜芯片檢測三種細胞的基因表達譜改變，進行兩兩對比篩選出上調2倍及以上的基因和下調2倍及以上的基因得到

13、三組數據。將初篩得到的三組差異表達基因分別進行cell—cycle、Wnt、Notch和TGF—βpathway的分析。 結果：通過對三種細胞的基因表達譜進行兩兩比較，經初步篩選后上調2倍及以上的基因分別有3423條、1014條和2441條；下調2倍及以上的基因分別有2524條、2546條、4266條。cell—cycle、Wnt、Notch和TGF—βpathway分析結果顯示cell—cycle pathway在三組數據中都