靶向下調(diào)大鼠脊髓背角內(nèi)VGLUT2基因?qū)ν庵芡从X信息傳遞的影響.pdf

1、疼痛是人們?cè)诓煌牟±頎顟B(tài)下由大腦所產(chǎn)生的一種不愉悅的感覺,而長(zhǎng)期的慢性痛則在全世界的范圍內(nèi)成為嚴(yán)重影響患者生命質(zhì)量的重要疾病。因此,闡明疼痛發(fā)生和傳遞的機(jī)制,開發(fā)更有效的鎮(zhèn)痛新藥以及臨床上對(duì)于疼痛的靶向治療,已經(jīng)成為當(dāng)今生命科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題[1]。
　　背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)和脊髓背角是軀體感覺信息(包括痛覺信息)傳遞和調(diào)控的初級(jí)門戶,位于其內(nèi)的谷氨酸在外周痛覺信息的傳遞中具有重要作

2、用。已有的研究證實(shí),在對(duì)痛覺信息的傳遞和調(diào)控過程中,谷氨酸是其中最主要的神經(jīng)遞質(zhì)之一,谷氨酸在神經(jīng)元的胞體合成后須由突觸囊泡進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)并胞吐釋放才能發(fā)揮其興奮性遞質(zhì)的作用,這種轉(zhuǎn)運(yùn)方式又必須借助特定的囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(vesicular glutamate transporters,VGLUTs)來完成。近10年,研究人員利用快速發(fā)展的分子生物學(xué)技術(shù)成功地分離并克隆出了不同亞型的囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體,并將之命名VGLUT1、VGLUT2、

3、VGLUT3[2,3]。由于VGLUT1和VGLUT2廣泛分布于谷氨酸能軸突終末內(nèi),故目前在國(guó)際上人們已經(jīng)將VGLUT1和VGLUT2作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)谷氨酸能終末的特異性標(biāo)記物[4]。谷氨酸參與感覺信息的傳遞和調(diào)控的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)在于它不僅分布在投射神經(jīng)元內(nèi),在中間神經(jīng)元內(nèi)也有廣泛的分布,而新近研究也發(fā)現(xiàn)在長(zhǎng)傳導(dǎo)通路的各級(jí)核團(tuán)和中間神經(jīng)元內(nèi)均有 VGLUT2的分布;進(jìn)一步的研究也證實(shí)DRG和脊髓背角內(nèi)有大量的VGLUT2表達(dá)神經(jīng)元和軸突終末

4、[5]。
　　目前在國(guó)內(nèi)外由于缺乏針對(duì)VGLUT2特異性的激動(dòng)劑和拮抗劑,導(dǎo)致對(duì)VGLUT2所參與外周痛覺信息傳遞和調(diào)控機(jī)制的研究十分困難[6,7]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展,基因敲除技術(shù)很好的解決了這一難題。然而,基因敲除技術(shù)對(duì)于針對(duì)VGLUT2為疼痛的靶點(diǎn),作為臨床上開發(fā)有效的鎮(zhèn)痛藥而言顯然是不現(xiàn)實(shí)的。隨著基因阻斷技術(shù)的發(fā)展,RNA干擾技術(shù)(RNA interference,RNAi)為特定基因功能研究和相關(guān)疾病的治療提供

5、了一種全新的思路。
　　脊髓背角的中間神經(jīng)元(同樣作為軀體感覺信息傳遞和調(diào)控的關(guān)鍵部位),其內(nèi)的VGLUT2與外周疼痛信息的傳遞和調(diào)控的關(guān)系如何,到目前為止尚不十分清楚。另外,脊髓內(nèi)VGLUT2樣陽性終末由于既來源于初級(jí)傳入神經(jīng)元(DRG),也來自于脊髓中間神經(jīng)元本身,因此在慢性痛狀態(tài)下,這兩部分來源的VGLUT2究竟是怎樣參與痛覺信息的傳遞和調(diào)控的,目前也無文獻(xiàn)報(bào)道。針對(duì)這兩個(gè)問題,我們擬綜合采用RNA干擾技術(shù)結(jié)合順行束路追蹤、

6、免疫熒光組織化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)和電生理學(xué)技術(shù)從以下幾個(gè)方面進(jìn)行了研究。
　　第一部分:將攜帶有兩種不同VGLUT2 shRNA序列的慢病毒載體,感染在體外原代培養(yǎng)的脊髓神經(jīng)元,進(jìn)一步驗(yàn)證并篩選能夠最有效下調(diào)脊髓神經(jīng)元內(nèi)VGLUT2表達(dá)的慢病毒載體。
　　目的:驗(yàn)證已經(jīng)在體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元上篩選得到的可以特異性干擾VGLUT2表達(dá)的兩種慢病毒是否能夠有效地感染原代培養(yǎng)的大鼠脊髓神經(jīng)元,篩選出能夠最高效干擾培養(yǎng)脊髓神經(jīng)元內(nèi)的VGL

7、UT2基因表達(dá)的慢病毒。
　　方法:首先將這兩種重組慢病毒直接感染體外培養(yǎng)的胚胎大鼠脊髓神經(jīng)元,實(shí)驗(yàn)分為正常組、陰性對(duì)照組(空病毒載體組)、VGLUT2-shRNA-1組以及VGLUT2-shRNA-2組,分別觀察各組大鼠脊髓神經(jīng)元內(nèi)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表達(dá)情況;同時(shí)運(yùn)用免疫蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)技術(shù)檢測(cè)VGLUT2蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:免疫熒光組

8、織化學(xué)染色結(jié)果顯示:陰性對(duì)照組、兩組VGLUT2-shRNA慢病毒組脊髓神經(jīng)元內(nèi)均可以觀察到GFP的熒光,提示這些神經(jīng)元已經(jīng)被慢病毒載體高效地感染;但兩組VGLUT2-shRNA慢病毒組神經(jīng)元內(nèi)的VGLUT2的表達(dá)量要明顯比正常組和陰性對(duì)照組低。Western Blot結(jié)果顯示:兩組VGLUT2-shRNA慢病毒組脊髓神經(jīng)元內(nèi)VGLUT2蛋白的表達(dá)量明顯低于其他兩組的表達(dá)量（P<0.05),其中VGLUT2-shRNA-1組和VGLUT

9、2-shRNA-2組VGLUT2蛋白的表達(dá)量分別占正常組表達(dá)量的62.42±1.12％和66.07±1.33%,但兩組VGLUT2-shRNA慢病毒組組間的VGLUT2蛋白的表達(dá)量相比無明顯差異（P>0.05);陰性對(duì)照組和正常組之間相比也無明顯差異（P>0.05)。
　　結(jié)論:兩組VGLUT2-shRNA重組慢病毒均能高效地感染原代培養(yǎng)脊髓神經(jīng)元,并且能夠下調(diào)脊髓神經(jīng)元內(nèi)VGLUT2的表達(dá)。
　　第二部分:將在體外有效降低

10、VGLUT2的兩種shRNA重組的慢病毒,通過定位注射方式注入大鼠脊髓背角,進(jìn)而感染脊髓背角神經(jīng)元,觀察下調(diào)其內(nèi) VGLUT2的表達(dá)對(duì)SNL神經(jīng)病理性痛模型大鼠的機(jī)械性痛敏的影響。并利用膜片鉗技術(shù),在紅外可視膜片鉗下對(duì)下調(diào)脊髓背角內(nèi) VGLUT2表達(dá)后大鼠的離體脊髓薄片背角淺層神經(jīng)元的電生理特性進(jìn)行分析。
　　目的:觀察靶向下調(diào)大鼠脊髓背角內(nèi)VGLUT2的表達(dá)對(duì)動(dòng)物痛行為的改變以及對(duì)神經(jīng)元的電生理特性和突觸可塑性的影響。
　

11、　方法:(1)制備L5脊神經(jīng)結(jié)扎(spinal nerve ligation,SNL)的神經(jīng)病理性痛模型。(2)將在體外培養(yǎng)神經(jīng)元上有效下調(diào)VGLUT2表達(dá)的兩種shRNA重組慢病毒,通過定位注射方式感染大鼠脊髓神經(jīng)元,觀察對(duì)神經(jīng)病理性痛模型大鼠疼痛相關(guān)行為的影響。(3)體外培養(yǎng)急性分離的大鼠脊髓薄片,并感染有效降低VGLUT2的shRNA重組慢病毒載體,觀察對(duì)大鼠脊髓背角淺層神經(jīng)元的電生理特性的影響。
　　結(jié)果:(1)大鼠在SN

12、L術(shù)后第1 d即表現(xiàn)出明顯的機(jī)械性痛敏和熱痛敏,在第3 d時(shí)痛敏最為明顯。(2)重組的慢病毒可以高效地感染大鼠的脊髓背角神經(jīng)元并抑制其內(nèi)VGLUT2的表達(dá);Western Blot結(jié)果顯示:VGLUT2-shRNA-1組和VGLUT2-shRNA-2組VGLUT2蛋白的表達(dá)量下降,分別為正常組表達(dá)量的20.71±5.52%和19.74±3.92%;同時(shí)能夠降低大鼠對(duì)于傷害性熱和機(jī)械性刺激的反應(yīng)閾值,并明顯緩解SNL神經(jīng)病理性痛模型大鼠的

13、痛敏行為。(3)在體外培養(yǎng)急性分離的大鼠脊髓薄片上,脊髓背角神經(jīng)元感染病毒后其自發(fā)性興奮性突觸后電流(sEPSC)的幅度減小,頻率有所降低。
　　結(jié)論:靶向下調(diào)大鼠脊髓背角內(nèi)VGLUT2的表達(dá)能夠影響神經(jīng)元的功能并緩解大鼠的痛行為。
　　第三部分:利用neurobiotin順行束路追蹤技術(shù)區(qū)分出脊髓背角內(nèi)VGLUT2從DRG(初級(jí)神經(jīng)元)和脊髓背角(二級(jí)神經(jīng)元)的來源分布,并觀察SNL神經(jīng)病理性痛模型大鼠脊髓背角初級(jí)傳入終末

14、內(nèi)VGLUT2的時(shí)程變化。
　　目的:觀察SNL神經(jīng)病理性痛模型大鼠脊髓背角初級(jí)傳入終末內(nèi)VGLUT2的時(shí)程變化。
　　方法:利用neurobiotin順行束路追蹤技術(shù)標(biāo)記所有DRG向脊髓背角淺層的初級(jí)傳入纖維,利用VGLUT2的抗體標(biāo)記脊髓背角內(nèi)VGLUT2陽性終末的分布。通過neurobiotin/VGLUT2免疫熒光雙標(biāo)染色區(qū)分VGLUT2從DRG(初級(jí)神經(jīng)元)和脊髓背角(二級(jí)神經(jīng)元)的來源分布;并以此觀察SNL模型大

15、鼠在 L5脊神經(jīng)結(jié)扎后不同時(shí)間點(diǎn)脊髓背角內(nèi)初級(jí)傳入終末內(nèi) VGLUT2的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:在脊髓背角內(nèi)可以清晰地觀察到 neurobiotin順行標(biāo)記的初級(jí)傳入纖維和終末,同時(shí)也可觀察到部分陽性終末呈VGLUT2樣陽性,這些neurobiotin/VGLUT2雙標(biāo)軸突終末的數(shù)量(%)隨著SNL神經(jīng)病理性痛的時(shí)間延長(zhǎng)(0 d,1 d,3 d,5 d,7 d)而逐漸增多。
　　結(jié)論:脊髓背角初級(jí)傳入終末內(nèi) VGLUT2的表達(dá)