靶向下調(diào)RVM區(qū)TPH2表達(dá)抑制小鼠瘙癢及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　瘙癢被定義為一種能引發(fā)搔抓欲望的特異性皮膚不適感覺,通過搔抓來消除皮膚表面潛在的有害因素如寄生蟲等。同時(shí),瘙癢也是一些慢性疾病的表現(xiàn),如慢性膽汁郁積癥。由于對(duì)不同原因引起的瘙癢在感覺神經(jīng)回路中傳導(dǎo)機(jī)制的認(rèn)識(shí)不足或有限,導(dǎo)致目前缺乏對(duì)慢性瘙癢的有效治療手段。
　　瘙癢和慢性疼痛同屬于傷害性感覺,多數(shù)C-纖維可對(duì)誘導(dǎo)疼痛和誘導(dǎo)瘙癢的化合物作出反應(yīng),在二者傳導(dǎo)通路中起重要作用。腦干延髓頭端腹內(nèi)側(cè)區(qū)(rostralv

2、entromedialmedulla,RVM)是對(duì)脊髓水平傷害性刺激下行調(diào)節(jié)系統(tǒng)中的一個(gè)重要組成部分。并且RVM區(qū)內(nèi)的神經(jīng)元在脊髓傷害性信號(hào)傳導(dǎo)的抑制和易化作用中扮演著重要角色。最近的研究證實(shí),RVM區(qū)對(duì)脊髓水平的傷害性信號(hào)傳遞的易化作用促成了神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生與發(fā)展。據(jù)此可推測(cè),RVM區(qū)對(duì)脊髓水平的傷害性信號(hào)傳導(dǎo)的易化作用同樣可以促成慢性病理性瘙癢的形成。
　　最近的研究支持RVM區(qū)的5-HT系統(tǒng)參與組織和神經(jīng)損傷后脊髓水平傷

3、害性信號(hào)的下行易化作用。而且,脊髓的5-HT3受體活化被證實(shí)參與了脊髓損傷(spinalcordinjury,SCI)模型大鼠痛覺過敏的產(chǎn)生。抑制脊髓5-HT3受體可減少L5-L6脊神經(jīng)結(jié)扎模型(spinalnerveligation,SNL)的痛覺過敏。據(jù)此推測(cè)RVM區(qū)的5-HT能系統(tǒng)可能通過參與交感神經(jīng)的活化調(diào)節(jié)慢性瘙癢信號(hào)的傳遞。
　　目的：
　　1、為提供RVM區(qū)5-HT能神經(jīng)元參與慢性瘙癢的直接證據(jù),我們通過RVM

4、區(qū)注射神經(jīng)毒素5,7-雙羥色胺(5,7-DHT)選擇性化學(xué)破壞5-HT能神經(jīng)元后,觀察慢性瘙癢模型(經(jīng)頸背區(qū)皮內(nèi)注射組胺、氯喹、內(nèi)皮素-1誘導(dǎo))小鼠搔抓行為的變化。
　　2、基于色氨酸羥化酶-2(tryptophanhydroxylase-2,TPH2)是腦神經(jīng)元中5-HT的生物合成限速酶,同時(shí)也是中樞5-HT能神經(jīng)元的標(biāo)志物,本研究通過RNA干擾(RNAinterference,RNAi)技術(shù)抑制TPH2的合成,觀察慢性瘙癢模型

5、(經(jīng)頸背區(qū)皮內(nèi)注射組胺、氯喹、內(nèi)皮素-1誘導(dǎo))小鼠搔抓行為的變化,以確定下行5-HT在小鼠慢性瘙癢中的作用。
　　研究方法與結(jié)果：
　　1、構(gòu)建小鼠瘙癢模型
　　方法:雄性C57BL/6J小鼠(8-10周齡)隨機(jī)分為:正常對(duì)照組(N組,n=6);生理鹽水組(S組,n=6);組胺組(His組,n=6);氯喹組(CQ組,n=6)和內(nèi)皮素-1組(ET-1組,n=6)。正常對(duì)照組不接受任何處理,其余組分別在小鼠接受頸背部皮內(nèi)注

6、射生理鹽水(100μl)、組胺(500μg/100μl)、氯喹(200μg/100μl)、內(nèi)皮素(25ng/100μl)后,立刻以5min為一個(gè)周期記錄搔抓次數(shù),記錄30min。
　　結(jié)果:N組5.83±1.67次、S組5.67±1.11次、His組91.83±24.17次、CQ組117.67±24.00次、ET-1組187.83±38.50次。與N組、S組比較,His組、ET-1組、CQ組給予致癢劑后30min內(nèi)搔抓次數(shù)增多有統(tǒng)

7、計(jì)學(xué)差異(P<0.05);N組和S組之間比較給予致癢劑后30min內(nèi)搔抓次數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)變化(P>0.05)這些結(jié)果表明,皮內(nèi)注射組胺、氯喹和內(nèi)皮素-1可引起明顯的瘙癢行為學(xué)改變。
　　2、5,7-DHT選擇性破壞小鼠RVM區(qū)5-HT能神經(jīng)元對(duì)瘙癢的影響
　　方法:在RVM區(qū)注射生理鹽水(0.5μl)或神經(jīng)毒素5,7-DHT(2μg/0.5μl)選擇性消融5-HT能神經(jīng)元4d后,將雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為:組胺組(DHT

8、-His組,n=6)、氯喹組(DHT-CQ組,n=6)和內(nèi)皮素-1組(DHT-ET-1組,n=6)及相應(yīng)的對(duì)照組胺組(saline-His組,6只)、對(duì)照氯喹組(saline-CQ組,6只)和對(duì)照內(nèi)皮素-1組(saline-ET-1組,6只)。分別在小鼠接受頸背部皮內(nèi)注射組胺(500μg/100μl);氯喹(200μg/100μl);內(nèi)皮素(25ng/100μl)后,立刻以5min為一個(gè)周期記錄搔抓次數(shù),記錄30min。免疫組化檢測(cè)RV

9、M區(qū)5-HT能神經(jīng)元的破壞情況,和脊髓背角5-HT表達(dá)情況。
　　結(jié)果:各組30min內(nèi)搔抓次數(shù)分別為:saline-His組93.67±23.33次、saline-CQ組123.67±18.56次、saline-ET-1組184.33±35.00次、DHT-His組12.83±4.89次、DHT-CQ組18.33±5.33次、DHT-ET-1組60.33±10.33次。與RVM區(qū)給予生理鹽水的小鼠相比,RVM區(qū)給予5,7-DHT

10、組小鼠在給予致癢劑后與正常對(duì)照組相比搔抓次數(shù)顯著減少(P<0.05),RVM區(qū)給予生理鹽水不影響小鼠在給予致癢劑后的搔抓情況(P>0.05)。免疫組化檢測(cè)RVM區(qū)5-HT能神經(jīng)元標(biāo)記物TPH和脊髓背角5-HT,與正常組比較經(jīng)5,7-DHT處理過的小鼠其RVM內(nèi)5-HT能神經(jīng)元及脊髓背角5-HT陽性物明顯減少,經(jīng)生理鹽水處理組無明顯變化。這些結(jié)果表明,RVM區(qū)注射神經(jīng)毒素5,7-DHT選擇性破壞5-HT能神經(jīng)元后,可明顯減少由組胺、氯喹和

11、內(nèi)皮素-1誘發(fā)的搔抓次數(shù)。
　　3、小鼠TPH2shRNA慢病毒載體的構(gòu)建及干擾效率鑒定
　　方法:擬通過設(shè)計(jì)針對(duì)小鼠TPH2基因shRNA的寡核苷酸序列,克隆入質(zhì)粒GV118中。與pHelper1.0和pHelper2.0一起經(jīng)人胚腎293T細(xì)胞包裝產(chǎn)生病毒顆粒。經(jīng)濃縮、滴度測(cè)定后感染褐家鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞。通過熒光顯微鏡觀察病毒細(xì)胞形態(tài)及病毒表達(dá)情況、確定PC12細(xì)胞感染慢病毒合適的條件及MOI。Real-t

12、imePCR和Westernblot檢測(cè)我們構(gòu)建的病毒載體在PC12細(xì)胞中抑制TPH2的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:測(cè)序結(jié)果顯示本研究所構(gòu)建的LV-TPH2與LV-Con質(zhì)粒與設(shè)計(jì)合成的干擾序列一致。經(jīng)293T細(xì)胞包裝后所得到的病毒LV-TPH2-RNAi和LV-Con-RNAi滴度分別為:1×109TU/ml和2×109TU/ml。感染PC12細(xì)胞確定其MOI值為100。Real-timePCR和Westernblot檢測(cè)與正常對(duì)照組

13、相比其mRNA降低約50％,蛋白降低約60%,對(duì)照病毒組與正常組無明顯變化。這些結(jié)果表明,本研究成功構(gòu)建了小鼠TPH2shRNA慢病毒載體,并能有效的抑制PC12細(xì)胞中TPH2的表達(dá)。
　　4、運(yùn)用RNA干擾技術(shù)靶向抑制小鼠RVM區(qū)5-HT能神經(jīng)元TPH2的表達(dá)對(duì)瘙癢的影響
　　方法:在RVM區(qū)注射對(duì)照病毒和TPH2小干擾RNA病毒特異性減少5-HT能神經(jīng)元中功能型5-HT含量7d后,將雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為:組胺

14、組(TPH2-His組,6只);氯喹組(TPH2-CQ組,6只),內(nèi)皮素-1組(TPH2-ET-1組,6只),組胺組(Con-His組,6只);氯喹組(Con-CQ組,6只)和內(nèi)皮素-1組(Con-ET-1組,6只)。分別在小鼠接受頸背部皮內(nèi)注射生理鹽水(100μl);組胺(500μg/100μl);氯喹(200μg/100μl);內(nèi)皮素(25ng/100μl)后,立刻以5min為一個(gè)周期記錄搔抓次數(shù),記錄30min。免疫組化檢測(cè)RVM

15、區(qū)5-HT能神經(jīng)元的破壞情況,和脊髓背角5-HT表達(dá)情況。
　　結(jié)果:各組30min內(nèi)搔抓次數(shù)分別為:Con-His組104.17±11.56次、Con-CQ組119.50±20.50次、Con-ET-1組169.22±334.83次、TPH2-His組31.00±11.33次、TPH2-CQ組55.17±10.22次、TPH2-ET-1組48.00±5.33次。與正常對(duì)照組相比經(jīng)LV-TPH2-RNAi處理過的小鼠搔抓次數(shù)顯著減

16、少(P<0.05),經(jīng)LV-Con-RNAi處理的小鼠與正常對(duì)照組小鼠在搔抓次數(shù)上無明顯變化(P>0.05)。免疫組化檢測(cè)RVM區(qū)5-HT能神經(jīng)元標(biāo)記物TPH和脊髓背角5-HT,與正常組比較經(jīng)LV-TPH2-RNAi處理過的小鼠其RVM內(nèi)5-HT能神經(jīng)元及脊髓背角5-HT陽性物明顯減少,經(jīng)LV-Con-RNAi處理組無明顯變化。這些結(jié)果表明,RVM區(qū)注射TPH2的siRNA抑制TPH2表達(dá),,可明顯減少由組胺、氯喹和內(nèi)皮素-1誘發(fā)的搔抓

17、次數(shù),同時(shí)可檢測(cè)到脊髓背角5-HT陽性表達(dá)產(chǎn)物減少。
　　5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,兩組數(shù)據(jù)之間比較采用t檢驗(yàn),多組數(shù)據(jù)之間比較采用方差分析(ANOVA),P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　研究總結(jié)：
　　一、主要研究結(jié)果
　　1.RVM區(qū)注射5,7-DHT選擇性破壞5-羥色胺能神經(jīng)元后,可明顯抑制由組胺、氯喹和內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)的搔抓行為;<

18、br>　　2.RVM區(qū)注射重組siRNA慢病毒抑制TPH2表達(dá)后,可抑制由組胺、氯喹和內(nèi)皮素-1誘導(dǎo)的搔抓行為。
　　二、研究結(jié)論
　　1.RVM區(qū)5-HT能神經(jīng)元是瘙癢信號(hào)由脊髓傳遞至大腦過程中的重要環(huán)節(jié);
　　2.RVM區(qū)5-HT能信號(hào)通路在瘙癢信號(hào)傳遞過程中具有重要作用,可能不同程度參與調(diào)節(jié)不同類型瘙癢信號(hào)。
　　三、創(chuàng)新之處
　　1.本研究首次證實(shí)了RVM區(qū)5-HT能神經(jīng)元參與了瘙癢信號(hào)的傳遞;