膽囊癌組織相關(guān)蛋白的篩選與鑒定.pdf

1、背景： 原發(fā)性膽囊癌是惡性程度非常高的腫瘤，發(fā)病率有逐年上升的趨勢，晚期膽囊癌5年生存率低于5％，而早期膽囊癌預(yù)后較好，5年生存率可高于80％，但無特異性臨床表現(xiàn)，早期診斷困難，缺乏特異的診斷標(biāo)志，臨床上發(fā)現(xiàn)的早期膽囊癌多為意外性膽囊癌。膽囊結(jié)石并慢性膽囊炎是膽囊癌公認的危險因子，單個結(jié)石直徑＞3em是導(dǎo)致膽囊癌發(fā)生的重要原因。膽囊癌合并有膽囊結(jié)石發(fā)生率可高達94％。結(jié)石嵌頓引起膽管阻塞使膽汁淤積引起膽囊黏膜慢性炎癥、增生與膽囊

2、癌的癌變過程有千絲萬縷的關(guān)系。 研究目的： 在蛋白質(zhì)組學(xué)水平篩選和鑒定與膽囊癌致病相關(guān)的差異蛋白，以期找到與膽囊癌診斷、治療、預(yù)后相關(guān)的特異性標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)膽囊癌診療的新穎靶點，更好的探討和了解膽囊癌的發(fā)病機理。 研究方法： 本研究運用成熟的雙向電泳．質(zhì)譜鑒定技術(shù)，在10例原發(fā)性膽囊癌中，以膽囊結(jié)石并慢性膽囊炎、正常膽囊組織和部分癌旁正常膽囊組織作為對照，進行雙向電泳實驗，選取有代表的三次二維電泳實驗結(jié)果，

3、通過兩兩比較，滿足組間三次平行電泳實驗平均值±SD差大于2倍的條件，被認為差異表達，以此為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異蛋白表達點。選取依照膽囊組．癌前病變組．正常對照組或有下調(diào)趨勢，或有上調(diào)趨勢的差異表達點進行PMF-MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定工作，鑒定的標(biāo)準(zhǔn)包括分子量、等電點、質(zhì)譜檢測肽段在整個蛋白質(zhì)中的覆蓋率、匹配度分值，蛋自得分大于56被認為有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。鑒定數(shù)據(jù)經(jīng)MASCOT檢索，明確蛋白名稱。在此基礎(chǔ)上，選取部分感興趣

4、的上調(diào)和下調(diào)蛋白運用Realtime-PCR及其Western印跡方法從mRNA水平及蛋白質(zhì)水平兩個方面進行表達驗證。最后，選取有潛在意義的蛋白在大樣本的膽囊癌組織芯片中，進行免疫組化表達驗證。以探討蛋白之間的相關(guān)性以及與膽囊癌的臨床病理學(xué)行為的關(guān)系及意義。 結(jié)果： 第一部分雙向電泳試驗中，以膽囊結(jié)石并慢性膽囊炎和正常膽囊、癌旁組織為對照，共尋找到66個與膽囊癌相關(guān)的差異表達點，其中在膽囊癌中上調(diào)表達點21個，下調(diào)表達點

5、45個。26個蛋白差異點入選質(zhì)譜鑒定工作，鑒定出21個差異表達蛋白(部分蛋白重復(fù))，其中在膽囊癌中上調(diào)表達的10個，包括：膜聯(lián)蛋白A4，膜突蛋白，人纖維蛋白素原β鏈，肌凝蛋白、肌動蛋白-胞質(zhì)2、放射相關(guān)性蛋白3，血清白蛋白：下調(diào)的蛋白11個：血紅蛋白β亞基，肌動蛋白-大血管平滑肌，原肌凝蛋白α-1鏈，(肌動蛋白)凝溶膠蛋白，凝膠溶素膠原α-1(Ⅵ)鏈，超(過)氧化物歧化酶[銅-鋅]，半乳凝素-1，角蛋白Ⅱ型細胞支架，(中間絲)波形蛋白，

6、視黃醛脫氫酶1，熱休克蛋白HSP-90-β。其中下調(diào)蛋白視黃醛脫氫酶1為新穎發(fā)現(xiàn)，未見其與腫瘤的相關(guān)報道。 第二部分我們選取上調(diào)蛋白膜聯(lián)蛋白A4(AnnexinA4)、膜突蛋白(Moesin)及下調(diào)蛋白視黃醛脫氫酶1Retinal dehydrogenasel、熱休克蛋白90(Heat shock protein HSP90-beta)、波形蛋白(Vimentin)經(jīng)Realtime-PCR及WesternBlot驗證，結(jié)果表明

7、：膜聯(lián)蛋白A4及膜突蛋白在癌組織標(biāo)本中有高于對照組表達的趨勢，而視黃醛脫氫酶1在對照組中的表達有高于癌組織組的趨勢。由于樣本量少，在這部分中我們僅能做一個趨勢的判斷。最后AnnexinA4、Moesin及Retinaldehydrogenasel入選進入大樣本(59例)膽囊癌組織芯片免疫組化驗證，結(jié)果表明：在慢性膽囊炎及癌旁組織中ALDH1A1陽性表達，而AnnexinⅣ和Moesin呈陰性或為弱陽性表達，在59例膽囊癌組織中，ALDH

8、1A1，AnnexinⅣ和Moesin三者的表達率分別為62.7％(37/59)、42.4％(25/59)和35.6％(21/59)，統(tǒng)計結(jié)果表明慢性膽囊炎、癌旁組織、膽囊癌組織中三者表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。分析三者的表達關(guān)系與膽囊癌的臨床病理聯(lián)系表明：Moesin陽性表達與性別(男)、浸潤深度、肝臟轉(zhuǎn)移以及疾病進展呈正相關(guān)，AnnexinⅣ與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和疾病進展高度相關(guān)，而ALDH1A1疾病進展和組織分化呈負相關(guān)。同時三

9、者存在著Moesin與ALDH1A1呈負相關(guān)，Moesin與AnnexinⅣ呈正相關(guān)，而ALDH1A1與AnnexinⅣ無相關(guān)性的表達關(guān)系。 結(jié)論： 我們的結(jié)果提示：Moesin和AnnexinⅣ有可能成為膽囊癌診斷或生物治療的新穎靶點，其中，Moesin蛋白可能與雌激素受體相關(guān)的膽囊癌又千絲萬縷的關(guān)系。我們第一次發(fā)現(xiàn)并報道ALDH1A1蛋白在抑制膽囊癌的生長和分化中可能有重要的作用，其直接催化的產(chǎn)物維甲酸可能可以抑制膽