柑橘衰退病毒的進化與起源初步分析.pdf

1、柑橘衰退病(Tristeza)是由柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus，CTV)引起的一種具有經(jīng)濟重要性的病害，廣泛分布于世界各柑橘產區(qū)，對全世界的柑橘產業(yè)造成了嚴重的威脅。CTV屬于長線形病毒屬(Closterovirus)，病毒粒子呈11×2,000nm的長線形，基因組約19,300個核苷酸組成的止義單鏈RNA(+ssRNA)，是目前已知植物病毒基因組中最人的病毒，具有12個開放讀碼框(ORF)，可以編碼19種以

2、上的蛋白質產物，在5’端和3’端各有107nt和1275nt的非翻譯區(qū) (URT)。CTV存在復雜的株系分化現(xiàn)象，不同的CTV分離株能引起包括莖陷點、酸橙作砧木的甜橙和葡萄柚植株快速死亡在內的多種癥狀。隨著品種結構調整，莖陷點型柑橘衰退病為害日益加重。由于CTV在田間通過蚜蟲傳播，對其最有效的防治方法是應用弱毒株系交叉保護技術(MSCP)，而對其株系研究是應用該技術的基礎。 本研究從我國野生柑橘資源豐富的地區(qū)收集CTV分離株，經(jīng)

3、直接組織點免疫(DTBIA)和反轉錄．聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測，陽性樣品嫁接保存于網(wǎng)室錦橙實生苗上。應用RT-PCR擴增CTV分離株的主要衣殼蛋白基因(p25基因)，結合限制性內切酶Hinf I對PCR產物進行限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析，同時對CTV分離株的p25基因進行單鏈構象多態(tài)性(SSCP)分析，初步明確我國野生柑橘資源感染CTV及其分離株組群構成情況。同時，通過對野生柑橘上的CTV分離株及國內栽培甜橙及柚上的

4、強弱毒CTV代表分離株的部分基因片段(p23、p20、p13、p18、p25、p27、POL、HEL、k17)進行擴增測序，并同國外典型CTV分離株相應基因片段進行序列比對，繪制基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹狀分類圖進行遺傳進化分析，初步明確野生柑橘上的CTV分離株同國內外栽培品種上CTV分離株間的序列差異程度，為弱毒株保護技術的應用和衰退病毒的進化及起源分析提供相關依據(jù)。 主要研究結果： 1 野生柑橘品種的收集和CTV檢測分別從我

5、國云南、四川、重慶、廣西、湖南、江西等野生柑橘主要分布地區(qū)收集到79個野生柑橘樣品，經(jīng)中國農業(yè)科學院柑橘研究所國家果樹種質(重慶)柑橘圃鑒定后進行DTBIA和RT-PCR檢測，篩選出共有11個野生柑橘樣品攜帶CTV，帶毒率為13.9％，說明野生柑橘存在CTV的感染。 2野生CTV分離株的組群構成分析2.1 RFLP分析對野生柑橘上的11個CTV分離株p25基因經(jīng)RFLP分析，有72.7％的樣品出現(xiàn)單-p25/Hinf I RFL

6、P譜型，其中以第3組群為主，第1組群次之；有27.3％的樣品表現(xiàn)出p25/Hinf I RFLP第1、3組群和第2、3組群混合譜型。 有一個樣品含有p25/Hinf I RFLP第4組群，可能是具有潛在保護作用的弱毒株；另外一個樣品為第6組群。 2．2 SSCP分析通過對野生柑橘上的11個CTVp25基因的擴增產物進行SSCP分析，結果表明RFLP分析為混合組群的3個CTV分離株具有4條特征性譜帶外，其余分離株均只有兩條

7、特征性譜帶，說明在野生狀態(tài)下生存的柑橘植株主要受CTV株系的單一組群為害，并且SSCP分析與RFLP分析的結果相一致。 3進化起源分析將野生柑橘上的11個CIV分離株和國內栽培甜橙和柚上的強弱毒代表分離株位于基因組3’端的p23、p20、p13、p18、p25、p27和位于中部的RdRp和p33基因的交疊部分POL片段以及5’的HEL、k17基因片段進行擴增和測序。 3．1 同源性分析將上述9個基因片段的序列進行同源性比

8、對分析，結果表明11個野生CTV基因組的3’端的序列同源性較高，保守性較強，5’端的序列變異較大。在分析的9個基因片段中位于3’端的rp25基岡的保守性最高，野生柑橘上11個CTV分離株間的核苷酸和氨基酸序列的同源性分別為92.1％～99.5％和94.8％～100％，同國內栽培品種上的4個代表分離株以及國外栽培品種上的21個代表株之間的核苷酸和氨基酸序列的同源性分別為91.3％～99.5％和95.2％～100％，91.3％～99.6％和

9、194.3％～100％；11個野生CTV分離株位于基因組5’端的HEL基因片段的核苷酸和氨基酸序列同源性最低為77.0％和86.3％，k17基因片段的核苷酸和氨基酸序列同源性最低只有65.5％和63.2％。 3．2遺傳進化分析9個基因片段序列的遺傳進化分析表明，堿基含量15C

10、苷酸序列中堿基A的含量最高，C的含量最低；p20、p13、p18、POL、HEL、k17基因片段核苷酸序列中堿基T的含量最高，C的含量最低。低GC含量說明序列的突變率較低。 其中p25基因片段核苷酸序列中變異位點占總位點的25.2％，氨基酸序列中變異位點占總位點的17.5％；k17基因片段的變異最大，核苷酸序列中變異位點占總位點的50.7％，氨基酸序列中變異位點占總位點的55.1％；從野生柑橘樣品和國內外栽培品種上的CTV分離株

11、密碼子第一、二、三位的堿基替換的情況看，總的來說，具有編碼序列的共同特點：密碼子第三位的堿基替換數(shù)最多，其次為第一位，最少是第二位，轉換數(shù)多于顛換數(shù)，比率在2以上；p25、p27、p23、p20、p13、p18、POL、k17基因片段序列間的同義突變(d<,S>)和非同義突變(d<,N>)比較表明：序列間總的比較d<,S>大于d<,N>，而且差異顯著(P<0.05)，只有在含有國外栽培品種上的CTV分離株的分析組群的．HEL基因片段比對

12、序列中非同義突變與同義突變相比，無明顯的差異(P>0.05)。 CTV分離株間p25基因遺傳距離最小，5’端的遺傳距離逐漸增大。同源性較高的序列間的遺傳距離較小，同源性較低的分離株間遺傳距離較人。 從分析的位于CTV整個基因組不同位置的9個基因片段的同源性及遺傳變異的情況來說，在基因組的3’端同源性較高，遺傳變異較小，從3’端到5’端同源性逐漸降低，遺傳變異逐漸增大。d<,N>均顯著低于d<,s>(d<,N>/d<,S>

13、<1)，低d<,N>值表明分析的CTV 9個基因片段在進化過程中承受著凈化選擇，說明它們對CTV來說是重要的。 3．3系統(tǒng)發(fā)育樹構建以BYV或LIYV的相應基因核苷酸序列為外群對分析的CTV分離株9個基因片段核苷酸序列構建MP樹、NJ樹，每個基因片段核苷酸序列構建的MP、NJ系統(tǒng)發(fā)育樹除個別支系間的聚合關系有所不同外，兩種系統(tǒng)樹的拓撲結構基本是相似的。在系統(tǒng)發(fā)育樹的拓撲結構中，聚類在同一支上的分離株間的核苷酸和氨基酸序列同源性均

14、高于處于不同分支上的分離株。當把9個基因片段合并構建系統(tǒng)發(fā)育樹時，所得的進化樹和單個基因構建的系統(tǒng)發(fā)育樹中cTV分離株間的聚類情況基本是一致的。在單個基因和基因片段合并構建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，收集到的野生柑橘樣品上的11個CTV分離株并未在進化樹中聚類在同一簇，而是分散在不同的組群中，和國內外栽培品種上的CTV分離株聚類在一起，具有較復雜的親緣關系。然而具有相同癥狀的分離株聚類在同一簇上，說明致病性是構建系統(tǒng)發(fā)育樹的關鍵岡素，與CTV起源和

15、進化往往緊密相關。 4 總結綜上所述，柑橘在野生狀態(tài)下存在CTV的侵染，通過RFLP、SSCP分析發(fā)現(xiàn)感染的CTV分離株主要以p2.5/Hinf I RFLP單一組群構成，構成的主要組群同栽培品種上的主要組群相似。 從我國分離株和國外分離株間的核苷酸和氨基酸序列同源性、分離株序列間的遺傳變異分析以及構建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，分析的CTV 9個基因片段在進化過程中承受著凈化選擇，并且我國柚的弱毒分離株CT9可能是不同于所有其它分離株的

16、我國獨有株系。我國野生柑橘上CTV的主要構成組群同栽培品種上的相似，與國外栽培柑橘上的分離株有較高的序列相似性，在系統(tǒng)發(fā)育樹上同國內外栽培品種上的CTV分離株親緣關系較近，分析的11個野生CTV分離株分散在由不同國家分離株聚類的組群中，且往往有相似生物學特性的CTV分離株聚類相同組群，表明病原致病性與CTV的起源和進化有緊密關系，結合我國是柑橘的主要起源中心及柑橘的傳播過程，CTV在國內外不同環(huán)境條件選擇壓力下的生存特點，推測我國可能是