柑橘衰退病毒和柑橘黃化脈明病毒單克隆抗體的制備及其應(yīng)用.pdf

1、每年柑橘病毒病害都會(huì)對世界柑橘生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus，CTV）引起的柑橘衰退病和由柑橘黃化脈明病毒（Citrusyellow veinclearing virus，CYVCV）引起的柑橘黃化脈明病是目前危害柑橘的兩種重要病毒病害。為了掌握這兩種病毒病在我國的發(fā)生流行規(guī)律，進(jìn)而建立科學(xué)防控體系，急需建立對兩種病毒的快速、有效的檢測方法。而血清學(xué)檢測方法操作簡單、特異性好、靈敏度高

2、，且適合大規(guī)模樣品檢測，因此被廣泛應(yīng)用于植物病毒的診斷、流行規(guī)律分析、抗病育種和科學(xué)防控等方面。為此，本論文分別制備了CTV和CYVCV的特異、靈敏的單克隆抗體，并以其為核心分別建立了檢測這兩種病毒的特異、靈敏的血清學(xué)方法，從而為這兩種病毒病的診斷、流行病學(xué)分析和科學(xué)防控體系建立提供物質(zhì)和技術(shù)支撐。
　　(1)CTV單抗的制備及其檢測應(yīng)用:CTV重慶分離物的外殼蛋白基因(CP)用原核表達(dá)載體pET-28a在大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)的

3、重組蛋白通過Ni2+-NTA膠純化后作為抗原免疫BALB/c小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合、篩選和克隆獲得4株分泌抗CTV單抗的雜交瘤細(xì)胞株系(14B10、14H11、20D5和20G12)。間接ELISA方法測得4株單抗腹水的效價(jià)在10-6-10-7之間，Western blot分析顯示，4株單抗均能與CTV的CP發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)。以單抗為核心建立檢測CTV的dot-ELISA、Tissue blot-ELISA、TAS-ELISA三種檢測CT

4、V的血清學(xué)方法，其中dot-ELISA和TAS-ELISA可以檢測感染CTV病葉粗提液的靈敏度分別達(dá)到1∶2560和1∶10240倍稀釋(w/v，g/ml)。此外，利用制備的單抗研制出了檢測CTV的膠體金免疫試紙條，其檢測病葉的靈敏度達(dá)到1∶1280倍稀釋，從而實(shí)現(xiàn)CTV檢測的田頭化、快速化、傻瓜化。TAS-ELISA檢測靈敏度最高，可以很好地應(yīng)用于脫毒樹苗的檢測。田間調(diào)查顯示，CTV在我國重慶市、江西省和浙江省柑橘產(chǎn)區(qū)發(fā)生普遍，且血清

5、學(xué)方法的檢測結(jié)果與RT-PCR檢測結(jié)果的符合率達(dá)到99.5％以上。CTV單抗的制備及其靈敏、特異的血清學(xué)檢測方法的建立對我國CTV的檢測和防控具有重大作用。
　　(2)CYVCV單抗的制備及其檢測應(yīng)用:為了診斷、流行病學(xué)分析和控制CYVCV病害，本論文以原核表達(dá)的CYVCV外殼蛋白作為抗原免疫小鼠和兔子，分別制備了4株抗CYVCV的特異、靈敏的單抗和兔多抗。4株單抗腹水的間接ELISA效價(jià)在10-6-10-7之間，單抗均能特異性地

6、與CYVCVCP蛋白和CYVCV感染的柑橘葉片粗提液反應(yīng)。以單抗為核心建立檢測CYVCV的dot-ELISA、Tissue blot-ELISA、DAS-ELISA、TAS-ELISA四種血清學(xué)方法，其中dot-ELISA、DAS-ELISA和TAS-ELISA檢測CYVCV病葉的靈敏度分別達(dá)到1∶2560、1∶10240和1∶20480倍稀釋(w/v，g/ml)。用建立的血清學(xué)方法分析了來自我國重慶市、云南省果園125份疑似病毒病樣品