我國(guó)部分地區(qū)柑橘衰退病毒基因型研究.pdf

1、柑橘衰退病為柑橘上發(fā)生危害最嚴(yán)重的病毒病，在世晃主要柑橘產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。引起該病害的病原柑橘衰退病毒（Citrustristezavirus，CTV），屬于線形病毒科（Closteroviridae），長(zhǎng)線形病毒屬（Closterovirus）。根據(jù)其在寄主植物上所引起的不同癥狀，可分為速衰株系、莖陷點(diǎn)株系和弱毒株系。根據(jù)CTV基因組序列特點(diǎn)，可將其分為T(mén)36,VT，T3和T30基因型，其中T30為弱毒株系，其它為強(qiáng)毒株系。為明確我國(guó)發(fā)生

2、的CTV基因型特點(diǎn)及其混合發(fā)生狀況，本研究對(duì)來(lái)自我國(guó)部分地區(qū)的CTV進(jìn)行了分析，結(jié)果如下。
　　 1.比較分析了以總RNA為模板的常規(guī)RT-PCR、免疫捕捉RT-PCR(IC-RT-PCR)和試管捕捉RT-PCR(TC-RT-PCR)3種方法進(jìn)行CTV檢測(cè)及株系區(qū)分的效果，結(jié)果顯示，3種方法檢測(cè)CTV均具較好的檢測(cè)效果，但采用總RNA為模板時(shí)在進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)及株系鑒定時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶均相對(duì)更清晰些；其它兩種方法的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳

3、條帶雖相對(duì)較弱，不適合于用Bi-RT-PCR方法進(jìn)行CTV株系的鑒定，但可用于大量樣品的CTV檢測(cè)。
　　 2.采用Bi-RT-PCR技術(shù)，對(duì)來(lái)自不同地區(qū)的141份柑橘樣品進(jìn)行了CTV強(qiáng)毒和弱毒株系的鑒定。結(jié)果顯示，有107份柑橘樣品的CTV檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，帶毒率為75.8％，且所檢測(cè)到的CTV均為強(qiáng)毒株系。
　　 3.選取10份柑橘樣品，對(duì)其CP進(jìn)行了擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物的HinfⅠ/RFLP分析，根據(jù)Gillings(19

4、93)報(bào)道的分類(lèi)規(guī)則，初步確定來(lái)自樣品S45的CTV(CTV-S45)為HinfⅠ/RFLP類(lèi)群Ⅴ，LR1、S36、S37、S38和S39存在類(lèi)群Ⅲ和Ⅴ的CTV混合感染，而樣品S46為我國(guó)新鑒定出的類(lèi)群Ⅷ與類(lèi)群V的混合侵染。
　　 4.選取以上8個(gè)CTV感染的柑橘樣品及本研究室前期鑒定獲得的2個(gè)CTV單一分離物感染的柑橘樣品，采用10對(duì)基因型鑒定引物對(duì)其進(jìn)行基因型分析，結(jié)果顯示，除N21為VT基因型、N4為T(mén)30基因型CTV單一

5、感染外，5個(gè)樣品B15、B16、S36、S39和LR1存在基因型為VT、T36和T3的CTV混合感染；BX與S40存在4種基因型VT、T36、T3和T30的CTV混合感染；CTV-S45可能帶有T3和T30基因型。這些結(jié)果表明，CTV強(qiáng)致病性株系VT和T3型在我國(guó)發(fā)生普遍。
　　 5.對(duì)采用引物VT-K17擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了克隆及序列分析，結(jié)果顯示，所測(cè)定分離物可較為明顯地分為VT基因型與T30基因型兩大類(lèi)群。其中來(lái)自樣品S45的2

6、個(gè)分離物CTV-S45-2和CTV-S45-4與弱毒株系T30和T385親緣關(guān)系較近，其擴(kuò)增片段的核苷酸和氨基酸同源性分別在96.6％和94.9％。其它分離物與VT基因型聚為一類(lèi)，而在該基因型類(lèi)群中存在較大的分子變異，這些分離物可進(jìn)一步分為3個(gè)組群，不同組群間存在特異性的核苷酸和氨基酸位點(diǎn)差異。
　　 6.對(duì)CTV-S45的CP、K17和Pol基因及5'UTR作進(jìn)一步測(cè)序和序列分析，發(fā)現(xiàn)其CP基因編碼氨基酸序列與T30同源性較高