應用SELDI-TOF-MS篩選子宮內膜異位癥及子宮腺肌病在位內膜線粒體差異蛋白的研究.pdf

1、子宮內膜異位癥(endometriosis，EMs)是生育年齡婦女常見的良性疾病，它又可浸潤病灶周圍的正常組織，治療后易于復發(fā)，具有一定的“惡性”行為，近年來發(fā)病率有逐年升高趨勢，成為婦科疾病中的熱點問題。內異癥病因與發(fā)病機制至今未明，經血逆流、種植以及腹膜或間皮細胞化生是兩種被廣泛接受的學說，其中以Sampson的經血逆流種植學說為主導理論。經血逆流是婦女月經期常見的現象，可發(fā)生于80％-90％的月經周期，但臨床上僅10％-15％育齡

2、婦女罹患內異癥，這是Sampson學說無法解釋之處。新近的研究焦點聚焦于子宮在位內膜，有謂“在位內膜決定論”。有研究也表明內異癥患者在位內膜的一些生物因子表達異常，有別于正常子宮內膜，使其具有更強的粘附和侵襲能力。
　　 約有30％的子宮內膜異位癥患者同時合并子宮腺肌病(adenomyosis)，子宮腺肌病也是發(fā)生于女性生殖系統(tǒng)常見的良性病變，隨著診斷水平的提高，其發(fā)病率也呈上升趨勢。子宮腺肌病的發(fā)病機理尚未達成一致，其中被普遍

3、接受的假說是：子宮腺肌病起源于子宮內膜基底層，由于某些特異性酶的作用，子宮肌層的平滑肌纖維束間失去緊密的連接，同時基底層內陷，高水平雌孕激素刺激也可能是促進子宮內膜向肌層生長的原因之一?？梢?，在位內膜的侵襲性增強和肌層薄弱是子宮腺肌病形成的兩大重要要素。約15％的子宮腺肌病同時合并子宮內膜異位癥，以往認為子宮腺肌病是內在性的子宮內膜異位癥，但研究發(fā)現其發(fā)病機制和病理特點有別于外在性的子宮內膜異位癥，故有的學者建議將子宮腺肌病作為一種獨立

4、性的疾病進行研究.
　　 子宮內膜異位癥和子宮腺肌病的發(fā)病機制至今不明，診斷的金標準仍然依賴手術或病理檢查，因此臨床診斷困難，但其臨床癥狀和并發(fā)癥卻對女性健康和生育卻有著重大的影響。探討子宮內膜異位癥和子宮腺肌病的發(fā)病機制，尋找微創(chuàng)、靈敏、特異的標志物成為基礎研究向應用研究過渡的熱點之一。
　　 線粒體不僅是機體的能量代謝中心，而且還參與多種重要的細胞病理過程。線粒體也有可能成為癌癥和其他疾病早期篩查、風險評估和診斷的新

5、標志物，同時為尋找新的治療靶點和疾病干涉手段提供基礎。以往的研究中，子宮內膜異位癥和子宮腺肌病的線粒體功能變化研究甚少，僅有少量研究表明，氧化應激和線粒體DNA突變可能參與了內異癥的發(fā)生和發(fā)展，而子宮內膜異位癥和子宮腺肌病線粒體蛋白組學水平的研究，至今鮮有報道。
　　 蛋白質而并非核酸才是生命活動的具體執(zhí)行者和體現者，因此深入研究子宮內膜異位癥和子宮腺肌病的發(fā)病機制，尋找微創(chuàng)、特異、靈敏的標志物用于早期診斷和隨訪監(jiān)測，客觀上要求

6、在蛋白質組的水平進行進一步探索。近年來開展的表面增強激光解吸-電離-飛行時間質譜(SELDI-TOF-MS)技術為這一探索提供了優(yōu)良的技術平臺。這一方法最大的優(yōu)勢在于高通量、高靈敏度的實現了質譜技術對臨床樣本的直接檢測。
　　 本課題旨在應用SELDI-TOF-MS和生物信息學技術從子宮在位內膜中篩選子宮內膜異位癥和子宮腺肌病的差異表達線粒體蛋白并構建診斷模型；并將得到的線粒體差異蛋白與血清和內膜總蛋白標志物進行對比，以期找到適

7、合子宮內膜異位癥和子宮腺肌病早期診斷、監(jiān)測的候選標志物，為其分離、純化、解碼等進一步研究提供資源和基礎，為探索子宮內膜異位癥和子宮腺肌病的發(fā)病機制和治療靶點提供新思路。
　　 第一部分：應用SELDI-TOF-MS篩選子宮內膜異位癥在位內膜線粒體差異蛋白的研究
　　 目的：篩選子宮內膜異位癥在位內膜線粒體差異蛋白，并建立檢測模型。
　　 方法：采用SELDI-TOF-MS技術檢測24例內異癥在位內膜和29例對照患

8、者正常內膜組織中線粒體蛋白，并用支持向量機方法建立判別模型，用留一法評估模型的預測效果：采用卡方檢驗檢驗各類模型間特異度和靈敏度的差異，t檢驗檢驗不同臨床分期間蛋白質峰值表達差異。
　　 結果：1.內異組在位內膜/對照組正常內膜組織間共檢測到線粒體蛋白質峰78個，有統(tǒng)計學意義的差異蛋白質峰10個(P＜0.05)，其中5，574 m/z和9，378 m/z兩個蛋白質峰在內異組中的表達低于對照組，其余8個蛋白質峰在內異組呈現高表達；

9、5，574、7，573和7，965m/z三個蛋白質峰出現在增殖期，其它7個蛋白質峰均出現在分泌期。
　　 2.3個線粒體蛋白質峰（15，334，15，128和16，069 m/z）組合所構建的診斷模型（模型1）鑒別內異癥患者的特異度為86.2％，靈敏度為87.5％。
　　 3.分泌期內異組在位內膜/對照組正常內膜組織間共檢測到線粒體蛋白質峰69個，有統(tǒng)計學意義的差異蛋白質峰14個(P＜0.05)，其中5，367、5，43

10、2、9，526和9，378 m/z4個蛋白質峰在內異組中的表達低于對照組，其余10個蛋白質峰在內異組呈現高表達。
　　 4.3個分泌期線粒體蛋白質峰（7，615，5，432和15，868 m/z）組合所構建的診斷模型（模型2）鑒別內異癥患者的特異度為76.9％，靈敏度為80.0％，與模型1相比，無統(tǒng)計學差異。
　　 5.增殖期內異組在位內膜/對照組正常內膜組織間共檢測到線粒體蛋白質峰64個，均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)

11、。
　　 6.2個增殖期線粒體蛋白質峰（3，456 m/z和15，128 m/z）組合所構建的診斷模型（模型3）鑒別內異患者的特異度為87.5％，靈敏度為85.7％。
　　 7.內異組在位內膜/對照組正常內膜組織間檢測到的有統(tǒng)計學意義的10個線粒體差異蛋白質峰中，處于Ⅲ、Ⅳ期的內異癥患者15，334.15，128、7，573、15，868和7，982m/z五個蛋白質峰值的表達水平顯著高于臨床分期Ⅰ、Ⅱ的患者(P＜0.05

12、)，5，574和9，378 m/z兩個峰值在Ⅲ、Ⅳ期的內異癥患者的表達水平顯著低于臨床分期Ⅰ、Ⅱ的患者(P＜0.05）.另外3個蛋白質峰值在不同的臨床分期中表達無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　 第二部分：應用SELDI-TOF-MS篩選子宮腺肌病在位內膜線粒體差異蛋白的研究
　　 目的：篩選子宮腺肌病在位內膜線粒體差異蛋白，建立檢測模型，并將得到的線粒體差異蛋白與第一部分得到的子宮內膜異位癥線粒體差異蛋白進行對比。<

13、br>　　 方法：采用SELDI-TOF-MS技術檢測13例子宮腺肌病在位內膜和29例對照患者正常內膜組織中線粒體蛋白，并用支持向量機方法建立判別模型，用留一法評估模型的預測效果。
　　 結果：1.腺肌病組在位內膜/對照組正常內膜組織間共檢測到線粒體蛋白質峰82個，兩組間有統(tǒng)計學意義的差異蛋白質峰1個。
　　 2.3個線粒體蛋白質峰（7，614，14，978和6，370 m/z)組合所構建的診斷模型鑒別子宮腺肌病患者的

14、特異度為93.1％，靈敏度為84.6％。
　　 3.14個線粒體蛋白質峰同時出現在內異組和腺肌病組，其中3，499m/z的峰在兩組中有統(tǒng)計學差異(P=0.029)，其余13個峰值在兩組中的表達無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；3，384，3，499，4，237和5，388m/z的蛋白質峰在內異組和腺肌病組有相反的表達趨勢，其余10個峰值在兩組中有相同的表達趨勢。
　　 結論：
　　 1.子宮內膜異位癥和子宮腺肌病患者

15、在位內膜與對照組正常內膜相比有差異表達的線粒體蛋白，在位子宮內膜線粒體蛋白的變化可能與內異癥和子宮腺肌病的發(fā)生有關。
　　 2.內異癥患者在位內膜與對照組正常內膜相比大部分差異表達的線粒體蛋白質峰出現在分泌期，分泌期內膜線粒體蛋白可能在內異癥形成過程中較增殖期內膜線粒體蛋白發(fā)揮了更大的作用。
　　 3.在內異癥中有差異表達的7個線粒體蛋白質峰與內異癥臨床分期有相關性，提示在位子宮內膜線粒體蛋白的變化可能與內異癥的發(fā)展、預

16、后有關。
　　 4.內異癥在位內膜線粒體差異蛋白與內異癥血清蛋白標志物相比，無吻合的蛋白質峰，可能是蛋白質從細胞內到血液循環(huán)的過程中經過了修飾、剪接等過程，進而造成了分子量的改變。
　　 5.內異癥在位內膜線粒體差異蛋白與內異癥在位內膜總蛋白標志物相比較，有3個吻合的蛋白質峰，對這些蛋白質峰進行分離、純化和解碼是下一步的重要工作。
　　 6.組合線粒體蛋白標志物（15，334，15，128和16，069 m/z）