乙型肝炎病毒截短型表面抗原中蛋白結合蛋白基因的篩選研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是嚴重影響我國人民健康的重要傳染病，可引起急、慢性病毒性肝炎，導致肝纖維化(LC)，甚至肝細胞癌(HCC)。HBV感染致肝細胞損傷機制，很大程度上與病毒蛋白和宿主細胞蛋白間的相互作用相關。因此，研究HBV抗原成分與宿主細胞蛋白相互作用及其機理能在一定程度上對HBV的致病機制做出解釋，為尋找有效防治HBV的方法提供新線索。 HBV基因組具有4個主要的開放讀碼框架(ORF

2、)，分別命名為S、C、P、X區(qū)，其中S區(qū)通過三個框架(in-frame)內(nèi)起始密碼子(ATG)分為三個結構域：前-S1，前-S2和S結構域，由此3個ATG開始編碼產(chǎn)生3種大小不同的表面抗原蛋白：主蛋白(SHBs)，中蛋白(MHBs：前-S2+S)和大蛋白(LHBs：前-S1+前-S2+S)。完整的MHBs多肽鏈是由55個aa的PreS2區(qū)和226個aa的S區(qū)組成的，研究表明，羧基末端截短形式的HBV表面抗原中蛋白(MHBs<'t>)具有

3、反式調(diào)節(jié)功能，在HBV致病(癌)過程中發(fā)揮著重要的作用，但MHBs<'t>與宿主細胞的結合蛋白目前還不十分清楚。 為研究羧基末端截短形式的HBV表面抗原中蛋白的結合蛋白，本實驗應用酵母雙雜交技術篩選表達型cDNA白細胞文庫中與MHBs<'t>的結合蛋白的基因。酵母雙雜交是一種研究蛋白．蛋白間相互作用的比較快速、可靠并可大規(guī)模篩選的技術。本實驗采用酵母雙雜交系統(tǒng)-3，利用兩種單倍體酵母a和α接合型可以配合形成二倍體，而其中表達的外

4、源蛋白仍能相互作用，免去了低效率文庫質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的問題，大大提高了雜交效率：在原技術基礎上增加了3個報告基因，降低了假陽性率，保證實驗結果的真陽性率達95％。我們首先利用多聚酶鏈反應(PCR)方法擴增羧基末端167位aa截短的HBV表面抗原中蛋白的基因編碼序列，經(jīng)酶切鑒定正確并連接入酵母表達載體pGBKT7中構建“誘餌”質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化酵母細胞AHl09(a型)并在其內(nèi)表達，Western-blotting驗證。然后與轉(zhuǎn)化了人白細胞c

5、DNA文庫質(zhì)粒pACT2的酵母細胞Y187(α型)進行配合。 結果成功克隆出MHBs<'t>蛋白并在酵母細胞中表達，配合后選出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培養(yǎng)基又能在鋪有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四缺培養(yǎng)基上生長并變成藍色的菌落10個。提取陽性酵母菌落的質(zhì)粒，電穿孔法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，接種在氨芐青霉素-LB平板上選擇并測序，經(jīng)生物信息學分析，排除讀碼框架不正確者，最后得到9種已知基因，ADP核糖基因子

6、2個，RAB6相互作用蛋白1個，CCR4-NOT轉(zhuǎn)錄復合體亞基10(CCR4-NOT-10)1個，脂多糖蛋白結合蛋白(LBP)1個，醛縮酶B(AI．,DOB)1個，補體成分3(C3)1個，丙酮酸脫氫酶(PDH)1個，人類細菌人工染色體(BAC)1個。 為進一步確證經(jīng)酵母雙雜交技術篩選出的結合蛋白與誘餌蛋白間在體外也有相互作用，我們擴增出脂多糖結合蛋白(LBP)基因并克隆入酵母表達載體pGADT7，在TNT網(wǎng)織紅細胞裂解物體外翻譯