乙型肝炎病毒e抗原相互作用蛋白基因的克隆化及功能的初步研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(HBV)感染致肝細胞損傷的機制,與病毒蛋白和肝細胞蛋白間的相互作用密切相關.而乙型肝炎e抗原(HBeAg)是由HBV DNA前-C基因區(qū)編碼的一種非顆粒性的分泌蛋白,隨HBV復制而增加,臨床上將其作為判斷HBV活動性復制的指標之一.因此研究HBeAg與肝細胞內蛋白的相互作用及其機理,能在一定程度上對HBV的致病機制做出解釋,并為尋找有效防治方法提供新線索.酵母雙雜交技術是一種研究蛋白-蛋白間相互作用的比較快速、可靠并可大規(guī)

2、模篩選的方法.該實驗所采用酵母雙雜交系統(tǒng)-3,基于兩種單倍體酵母a和α型可以配合形成二倍體,而其中表達的外源蛋白仍能相互作用的機理,免去了低效率文庫質粒與誘餌質粒共轉染的問題,大大提高了雜交效率;在原技術基礎上增加了3個報告基因,降低了假陽性率.我們利用該技術,根據中國HBV流行株序列設計引物,應用多聚酶鏈反應(PCR)技術,由乙型肝炎患者血清中分離出HBeAg編碼基因序列.為進一步確證經酵母雙雜交技術篩選出的結合蛋白與HBeAg在體外

3、也存在相互作用,我們根據Genbank中提供的序列信息設計引物,以HepG2細胞的mRNA為模板,通過逆轉錄-PCR擴增出CD81及新基因AK026018的全序列,測序鑒定后,經相應的限制性內切酶消化后,克隆入酵母表達載體pGADT7,在TNT網織紅細胞裂解物中進行體外翻譯,摻入同位素<'35>S,與HBeAg進行體外免疫共沉淀反應,經SDS-PAGE電泳,-20℃條件下放射自顯影,再次證實上述蛋白間結合作用的可靠性.在新基因功能的研究