乙型肝炎病毒e抗原相互作用蛋白基因的克隆化及功能的初步研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(HBV)感染致肝細(xì)胞損傷的機(jī)制,與病毒蛋白和肝細(xì)胞蛋白間的相互作用密切相關(guān).而乙型肝炎e抗原(HBeAg)是由HBV DNA前-C基因區(qū)編碼的一種非顆粒性的分泌蛋白,隨HBV復(fù)制而增加,臨床上將其作為判斷HBV活動(dòng)性復(fù)制的指標(biāo)之一.因此研究HBeAg與肝細(xì)胞內(nèi)蛋白的相互作用及其機(jī)理,能在一定程度上對(duì)HBV的致病機(jī)制做出解釋,并為尋找有效防治方法提供新線索.酵母雙雜交技術(shù)是一種研究蛋白-蛋白間相互作用的比較快速、可靠并可大規(guī)

2、模篩選的方法.該實(shí)驗(yàn)所采用酵母雙雜交系統(tǒng)-3,基于兩種單倍體酵母a和α型可以配合形成二倍體,而其中表達(dá)的外源蛋白仍能相互作用的機(jī)理,免去了低效率文庫(kù)質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的問(wèn)題,大大提高了雜交效率;在原技術(shù)基礎(chǔ)上增加了3個(gè)報(bào)告基因,降低了假陽(yáng)性率.我們利用該技術(shù),根據(jù)中國(guó)HBV流行株序列設(shè)計(jì)引物,應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù),由乙型肝炎患者血清中分離出HBeAg編碼基因序列.為進(jìn)一步確證經(jīng)酵母雙雜交技術(shù)篩選出的結(jié)合蛋白與HBeAg在體外

3、也存在相互作用,我們根據(jù)Genbank中提供的序列信息設(shè)計(jì)引物,以HepG2細(xì)胞的mRNA為模板,通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-PCR擴(kuò)增出CD81及新基因AK026018的全序列,測(cè)序鑒定后,經(jīng)相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶消化后,克隆入酵母表達(dá)載體pGADT7,在TNT網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物中進(jìn)行體外翻譯,摻入同位素<'35>S,與HBeAg進(jìn)行體外免疫共沉淀反應(yīng),經(jīng)SDS-PAGE電泳,-20℃條件下放射自顯影,再次證實(shí)上述蛋白間結(jié)合作用的可靠性.在新基因功能的研究