半導體激光預(yù)照射對經(jīng)瞳孔溫熱療法生物學效應(yīng)的影響.pdf

1、經(jīng)瞳孔溫熱療法(transpupillary thermotherapy，TTT)是近年來用于治療脈絡(luò)膜新生血管的一種激光療法。該治療方法的特點是采用低能量、大光斑、長時間照射，使局部組織低升溫，來達到使脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)消退，又不對周圍組織造成損傷的目的。但目前對于TTT治療的機理卻了解甚少。許多學者曾對TTT照射后的組織進行病理學研究，發(fā)現(xiàn)組織內(nèi)存在熱休克蛋白高表達、細

2、胞凋亡等現(xiàn)象，推測其可能的機理是組織低升溫，使CNV血管內(nèi)皮細胞凋亡，同時低升溫促使熱休克蛋白高表達，減少了熱能對周圍組織的損傷。 本文前兩部分通過對正常大鼠視網(wǎng)膜或體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞行較高能量半導體激光(diode laser，DL)照射前，先予一次低能量DL預(yù)照射，探討DL預(yù)照射對受照射組織熱休克蛋白表達的影響以及對視網(wǎng)膜和血管內(nèi)皮細胞可能產(chǎn)生的作用。第三部分建立非激光誘導的色素兔CNV模型，為今后進一步探討TTT治療

3、的安全性及有效性提供實驗平臺。 第一部分：DL預(yù)照射對視網(wǎng)膜保護作用的探討 目的：低能量DL預(yù)照射大鼠視網(wǎng)膜20小時后再進行較高能量DL照射，探討DL預(yù)照射是否對視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層存在保護效應(yīng)，并討論該過程中視網(wǎng)膜Hsp70高表達的相關(guān)性。 對象與方法：26只挪威棕色大鼠按照隨機原則分為5組。A組：DL低能量(60 mW)預(yù)照射視網(wǎng)膜20小時后予第二次DL高能量(80 mW)照射，12小時后觀察。B組：未予低能量

4、DL預(yù)照射，直接行高能量照射，12小時后觀察。C組：只予DL低能量照射，36小時后觀察。D組：除未行DL照射外，其余操作均同A、B、C組。E組：空白對照。所有各組的觀察指標均為：眼底檢查、FFA、ICGA檢查，以及病理學檢查，并通過免疫組化、原位雜交以及Western B10t蛋白質(zhì)半定量法檢測視網(wǎng)膜Hsp70表達；以TUNEL法原位檢測視網(wǎng)膜組織內(nèi)凋亡，免疫組化法與Western B10t蛋白質(zhì)半定量法檢測視網(wǎng)膜活性Caspase 3

5、表達。 結(jié)果：各組大鼠眼底檢查均無異常，F(xiàn)FA檢查可見B組少量光斑存在熒光素滲漏，ICGA未見熒光染料積存。各組視網(wǎng)膜切片HE染色也未見組織結(jié)構(gòu)改變，光鏡、電鏡下均未見組織壞死。免疫組化法檢測結(jié)果顯示：各組視網(wǎng)膜Hsp70表達陽性，以內(nèi)、外叢狀層為主，DL照射組顯著高于對照組，其中A組視網(wǎng)膜Hsp70表達明顯高于B組、C組。Westerrl Blot結(jié)果與此一致。原位雜交法檢測結(jié)果視網(wǎng)膜內(nèi)、外叢狀層Hsp70 mRNA陽性表達

6、。TUNEL結(jié)果示DL照射后視網(wǎng)膜內(nèi)、外核層(INL、ONL)均可見不同程度細胞凋亡，并且外核層更多見，其中B組INL、ONL細胞凋亡率明顯高于A組和C組，D、E兩對照組未見明顯凋亡。DL照射后視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層活性Caspase 3免疫表達陽性，Wrestem B1Ot結(jié)果示B組視網(wǎng)膜活性Caspase 3表達明顯高于A組和C組，對照組表達不明顯。 結(jié)論：DL照射眼底雖無肉眼可見視網(wǎng)膜損害，但視網(wǎng)膜INL、ONL存在細胞凋亡。

7、高能量(80 mW)DL照射前先予低能量(60 mW)DL預(yù)照射，能夠減輕高能量DL照射引起的視網(wǎng)膜細胞凋亡。這一保護效應(yīng)可能與低能量DL誘導視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞自身保護性蛋白—Hsp70高表達，從而提高視網(wǎng)膜對熱的耐受能力有關(guān)。提示臨床對患者進行TTT治療前1天先予一次低能量DL預(yù)照射，有可能減輕TTT治療對視網(wǎng)膜的損害。 第二部分：DL預(yù)照射對血管內(nèi)皮細胞的影響 目的：探討在高能量DL照射血管內(nèi)皮細胞前先予一次低能量DL

8、預(yù)照射對體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞的影響，以及Hsp70高表達在此過程中可能產(chǎn)生的作用。 對象與方法：體外培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(ECV 304)。細胞內(nèi)加入ICG 15μg／ml后，分組予不同方式DL照射。A組：低能量(500 mW)DL預(yù)照射后20小時再行第二次高能量(900 mW)DL照射，12小時后觀察。B組：未予低能量DL預(yù)照射，直接予高能量DL照射后12小時進行觀察。C組：只予低能量DL照射后36小時觀察。D組：除不予

9、DL照射外，其余操作均同A、B、C組。E組：空白對照。所有各組細胞的觀察指標如下：光鏡、電鏡下觀察各組細胞結(jié)構(gòu)形態(tài)。免疫細胞化學法檢測細胞內(nèi)Hsp70表達。并收集細胞抽提總蛋白，Wrestem B1ot蛋白質(zhì)半定量檢測Hsp70在細胞內(nèi)的含量。同時行流式細胞儀檢測細胞存活率、凋亡率與壞死率。免疫細胞化學法及Westem Blot法檢測細胞內(nèi)活性Caspase 3的含量。結(jié)果：流式細胞儀檢測結(jié)果B組細胞壞死率(47.21％)明顯多于A組

10、(21.45％)和C組(1.49％)，B組細胞凋亡率(18.34％)顯著少于A組 (41.22％)，C組凋亡率(7.20％)與正常對照相近。D、E組凋亡、壞死均不明顯(凋亡率分別為5.14％、2.98％，壞死率分別為1.55％、O.96％)。免疫細胞化學法檢測示胞漿內(nèi)活性Caspase 3表達陽性。Westem B10t法結(jié)果示活性Caspase 3含量：B組明顯低于A組。免疫細胞化學實驗結(jié)果不：DL照射組細胞胞漿內(nèi)Hsp70強陽性，其

11、中A組明顯高于B組，對照組細胞胞漿內(nèi)Hsp70弱陽性。Western Blot結(jié)果示：Hsp70表達可見于所有細胞，但DL照射組明顯高于對照組，且A組明顯高于B組。 結(jié)論：低能量(500 roW)DL預(yù)照射后再予高能量(900 mW)DL照射體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞，能夠顯著減少細胞壞死，從而減少細胞內(nèi)炎性介質(zhì)釋放導致的局部炎性反應(yīng)。該效應(yīng)可能與低能量DL誘導細胞內(nèi)Hsp70高表達，抗細胞壞死作用有關(guān)。提示：臨床采用TTT治療C

12、NV前l(fā)天，先予一次低能量DL預(yù)照射，有可能減輕TTT治療時引發(fā)的局部炎性反應(yīng)，從而減少CNV再形成的可能。 第三部分：堿性成纖維細胞生長因子誘導色素兔脈絡(luò)膜新生血管形成 目的：探討堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)誘導青紫蘭色素兔脈絡(luò)膜新生血管模型的方法及可行性，嘗試建立脈絡(luò)膜新生血管的非激光誘導模型。 方法：健康成年青紫蘭色素兔40只，隨機分為二組。A組為實驗組，視網(wǎng)膜下注入0.005％(wt/v01)bF

13、GF 50μl，B組為對照組，視網(wǎng)膜下注入0.9％生理鹽水50μl，對側(cè)眼都作空白對照，不行視網(wǎng)膜下注射。視網(wǎng)膜注射后3天，1、2、3、4、6、8、12周分別行眼底檢查、FFA、ICGA，并行眼球組織病理學檢查。 結(jié)果：視網(wǎng)膜下注射后所有眼均即見視網(wǎng)膜直徑4-5PD青灰色半球形隆起，A組與B組隆起的視網(wǎng)膜分別于注射后2周和1周左右平復(fù)。視網(wǎng)膜下注射bFGF后2-12周FFA檢查可見原注射隆起處下方造影早期出現(xiàn)斑點狀高熒，后期高

14、熒斑逐漸融合擴大，熒光強度逐漸增強。ICGA顯示FFA高熒相應(yīng)部位熒光染料積存。對照眼FFA、ICGA檢查均未見明顯高熒灶或熒光染料積存。病理檢查結(jié)果顯示：視網(wǎng)膜下注射bFGF后2-12周，視網(wǎng)膜下有脈絡(luò)膜新生血管形成。 結(jié)論：視網(wǎng)膜下注入具有生物活性的bFGF能夠成功誘導色素兔脈絡(luò)膜 新生血管形成。該動物模型可重復(fù)性較好，能夠模擬人眼CNv的病理狀態(tài)，可用作研究CNV的疾病轉(zhuǎn)歸、評價安全有效的防治手段的實驗平臺，尤其適