玉米彎孢葉斑病菌毒素化學(xué)及作用機(jī)理研究.pdf

1、本文首次對(duì)玉米彎孢葉斑病菌毒素的離體產(chǎn)生條件、基本特性、專化性特點(diǎn)、毒素對(duì)寄主細(xì)胞質(zhì)膜的傷害機(jī)制及活性成份分離、純化技術(shù)及化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。為了解玉米彎孢葉斑病菌毒素的致病機(jī)理、不同品種玉米的抗性反應(yīng)及毒素活性物質(zhì)的化學(xué)成份，從而為玉米抗病育種和科學(xué)利用玉米彎孢葉斑病菌毒素是提供可靠的理論基礎(chǔ)。具體的研究結(jié)果如下： 首次對(duì)玉米彎孢葉斑病菌毒素的產(chǎn)生條件進(jìn)行研究，得到最佳培養(yǎng)條件：(1)玉米彎孢葉斑病菌在幾種供試培養(yǎng)基中，

2、在改良Fries培養(yǎng)基產(chǎn)毒能力最強(qiáng)；(2)玉米彎孢菌在25℃時(shí)培養(yǎng)液的毒力作用最大；(3)當(dāng)培養(yǎng)液的pH為8時(shí)，彎孢菌產(chǎn)毒能力最強(qiáng)；(4)光暗交替、振蕩培養(yǎng)的狀態(tài)下產(chǎn)毒最佳；(5)產(chǎn)毒的最佳時(shí)間為20d。這些條件與其菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢有一定差異，表明玉米彎孢葉斑病菌的生長(zhǎng)與產(chǎn)毒條件并不完全一致。 玉米彎孢葉斑病菌毒素粗提液的基本特性研究顯示：(1)毒素粗提液在60℃和100℃的溫度下處理一段時(shí)間后仍有生物活性；(2)當(dāng)用甲醇處理毒素

3、粗提液后，非蛋白部分具有致病活性，據(jù)此可以玉米彎孢葉斑病菌毒素為一類極性較大的非蛋白類物質(zhì)；(3)該毒素對(duì)光不敏感，在用光照處理后仍具有活性；(4)用不同的有機(jī)溶劑萃取后，萃取濃縮液的生物活性非常小，因此在分離毒素時(shí)，不宜采用萃取的方法。毒素這些基本性質(zhì)的揭示為分離純化毒素提供了可靠的依據(jù)。 玉米彎孢葉斑病菌毒素致病機(jī)理的研究：(1)毒素處理不同抗性的玉米品種，細(xì)胞外滲液的電導(dǎo)率值有很大差別，抗病品種的電導(dǎo)率值明顯低于感病品種；

4、而且處理時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞膜的透性越大；(2)用細(xì)胞中MDA的含量，表示膜脂過(guò)氧化程度，抗病品種的MDA值較低(0.42/24h)，感病品種的MDA值較高(0.79/24h)。從而可以說(shuō)明抗病品種細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度低，對(duì)毒素具有抗性，這也是抗病性在細(xì)胞膜上的反應(yīng)。(3)毒素對(duì)寄主防御酶系的影響，可以看出處理植株體內(nèi)的酶活性明顯高于對(duì)照；抗病品種酶活性要高于感病品種，酶活性迅速被毒素激發(fā)。 毒素分離純化及化學(xué)結(jié)構(gòu)的研究表明：(1)通過(guò)

5、對(duì)薄層層析展開(kāi)劑的篩選，得出正丁醇：甲醇：水(60：15：30)為最佳展開(kāi)劑。(2)通過(guò)洗脫曲線確定最佳柱層析的填料，kp-18硅膠(50μ)為最佳填料，培養(yǎng)液的各組分得以分離。(3)Rp-18硅膠柱反復(fù)柱層析，不同濃度的甲醇水溶液為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，最后結(jié)晶和重結(jié)晶得到毒素的純物質(zhì)。在分離過(guò)程中，每一步都要以生物測(cè)定結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)。毒素的結(jié)構(gòu)分析研究：(1)通過(guò)紫外光譜的測(cè)定，該毒素在216nm處存在最大吸收峰。 (2)紅外光譜的結(jié)果顯

6、示，該化合物中可能存在-OH、-CH、-CH<,2>、-CH<,3>、C-O、-C-N等官能團(tuán)，1464 cm<'-1>：亞甲基的剪式振動(dòng)吸收峰，因?yàn)檫@些吸收峰強(qiáng)度較大，所以推測(cè)結(jié)構(gòu)中含有較多-CH<,2>基團(tuán)。(3)質(zhì)譜譜圖中可見(jiàn)多個(gè)具有m/z為14的碎片，221-207、147-133、89-75等，推測(cè)結(jié)構(gòu)中可以產(chǎn)生較多的CH<,2>碎片。(4)核磁共振的碳譜中可見(jiàn)2個(gè)連氧sp3雜化碳信號(hào)(δ 69.1，66.7)，可以認(rèn)為是醚鍵

7、的兩個(gè)直接相連C信號(hào)；在高場(chǎng)區(qū)可見(jiàn)重疊的sp3雜化碳信號(hào)，認(rèn)為是長(zhǎng)鏈烴基的C信號(hào)。根據(jù)以上信息，推測(cè)該化合物為一脂肪族醚類化合物。 毒素除草活性的研究： (1)玉米彎孢葉斑病菌毒素不僅對(duì)玉米種子的萌發(fā)有抑制作用，而且對(duì)雜草種子的萌發(fā)也有不同程度的抑制作用，說(shuō)明該毒素為非寄主專化性毒素。(2)該毒素對(duì)黃瓜種子的萌發(fā)略有抑制作用，對(duì)水稻、白菜、羅卜都是安全的。(3)毒素不僅可以抑制雜草種子的萌發(fā)，而且對(duì)雜草幼苗有致萎作用。因此本研究