中國(guó)玉米彎孢葉斑病菌致病性分化相關(guān)蛋白質(zhì)組研究.pdf

1、玉米彎孢葉斑霉菌(Curvularia lunata(Wakker)Bocd)是引起玉米彎孢葉斑病的主要真菌病害，存在著嚴(yán)重的致病性分化。本實(shí)驗(yàn)利用蛋白質(zhì)雙向電泳、PDQuest2-D分析軟件、MALDI-TOF MS質(zhì)譜分析技術(shù)首次在蛋白質(zhì)組水平系統(tǒng)研究了中國(guó)玉米彎孢菌的致病性分化相關(guān)蛋白表達(dá)差異及在寄主選擇壓力下致病性演化過(guò)程中蛋白質(zhì)組消長(zhǎng)規(guī)律；克隆了玉米彎孢菌致病性分化相關(guān)基因，研究了該基因在不同菌株不同生長(zhǎng)階段的組織表達(dá)差異；系

2、統(tǒng)研究了玉米彎孢葉斑病菌致病相關(guān)因子黑色素的理化性質(zhì)，明確了黑色素在玉米彎孢葉斑病菌致病性分化中的作用。主要內(nèi)容包括： 構(gòu)建了適用于玉米彎孢葉斑病菌菌絲全蛋白分離的2-DE優(yōu)化技術(shù)體系。蛋白質(zhì)裂解液以8M尿素，2M硫尿，100mM DTT，4％CHAPS，10mM PMSF，10％異丙醇，0.25％Tween-20，40mM Tris，0.25％兩性電解質(zhì)，5％甘油，0.002％溴酚藍(lán)組成的裂解液制備樣品效果較好；制備型蛋白質(zhì)凝

3、膠染色以0.25％G250的CBB染色方法最佳；12.5％聚丙烯酰胺凝膠分離效果最理想；等電聚焦以24000伏小時(shí)為最優(yōu)。 比較了玉米彎孢葉斑病菌強(qiáng)病株系(CX-3，SD-60、C.152)和弱致病株(DD-60、WS-18、C107-1)蛋白質(zhì)圖譜的差異。可溶性蛋白的SDS-PAGE電泳獲得了110條蛋白質(zhì)條帶，其中68條(61.82％)為多態(tài)性條帶，表明菌株間存在著較大的分化。聚類分析表明，幾個(gè)菌株在閾值為0.605時(shí)分為三

4、組，第一組包括具有較多的蛋白質(zhì)條帶的CX-3、SD-6、C-152以及WS-18，除WS-18外，接種鑒定為強(qiáng)致病類型，第二組和第三組包括C107-1和DD-60二個(gè)菌株，接種鑒定表現(xiàn)出弱致病性，表明病原菌可溶性蛋白的多態(tài)性與其致病性分化密切相關(guān)。 首次獲得了玉米彎孢葉斑病菌不同致病類型間差異蛋白質(zhì)組圖譜。利用蛋白質(zhì)分離的雙向電泳技術(shù)分離出423個(gè)蛋白質(zhì)，其中75個(gè)為差異蛋白質(zhì)，包括28個(gè)蛋白質(zhì)為強(qiáng)致病性菌特有蛋白質(zhì)，8個(gè)蛋白質(zhì)

5、為弱致病菌特有蛋白質(zhì)，39個(gè)蛋白質(zhì)在兩種致病類型中均有發(fā)現(xiàn)，但是蛋白質(zhì)表達(dá)豐度不同；采用MALDI-TOF-MS方法鑒定出20個(gè)致病分化差異蛋白，包括病原真菌致病分化密切相關(guān)的Brnl，UBSR1和HSP等蛋白；參與病菌物質(zhì)代謝、能量代謝、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白及功能未知蛋白。在這些蛋白中，Brnl蛋白是參與病原菌黑色素合成且與致病性分化關(guān)系最為密切的蛋白之一。首次研究了玉米彎孢葉斑病菌在寄主選擇壓力下致病性演化的蛋白質(zhì)組消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)。采用弱致病

6、菌株繼代接種方法，分離并鑒定了繼代接種后消失的蛋白3個(gè)，接種后誘導(dǎo)后出現(xiàn)的新蛋白4個(gè)，誘導(dǎo)后表達(dá)豐度增加的蛋白5個(gè)。這些蛋白中包括了參與信號(hào)識(shí)別及能量代謝、物質(zhì)代謝的P115A糖蛋白、ACR056Wp、ADR311Cp及GTP-binding nuclear protein RAN/TC4，也包括了病原真菌致病分化密切相關(guān)的Brnl蛋白、scytalone脫氫酶等。 采用RACE技術(shù)克隆了玉米彎孢葉斑病菌致病性分化密切相關(guān)Brn

7、l蛋白基因。根據(jù)質(zhì)譜測(cè)定的氨基酸序列設(shè)計(jì)引物，克隆出BrnJ cDNA全長(zhǎng)1001bp序列(GenBank accession No．DQ358052)，含801 bp的開放閱讀框，編碼267個(gè)氨基酸，推測(cè)蛋白質(zhì)分子量為43 KD；序列的同源性分析結(jié)果表明，該基因是參與病原真菌中黑色素合成的一個(gè)重要基因。采用半定量PCR方法，比較了Brnl基因在玉米彎孢菌不同生長(zhǎng)階段的表達(dá)規(guī)律，結(jié)果表明Brnl基因在96 h的表達(dá)量明顯大于24h，72

8、 h的表達(dá)量，差異達(dá)極顯著；在菌株生長(zhǎng)的24 h、72 h和96 h，Brnl基因在玉米彎孢菌強(qiáng)致病菌株中的表達(dá)大于弱致病菌株，差異達(dá)極顯著，說(shuō)明該基因的表達(dá)與病原菌的致病性密切相關(guān)。 研究了玉米彎孢葉斑病菌黑色素的理化性質(zhì)。采用酸堿沉淀浸提法提取了彎孢菌胞內(nèi)及胞外黑色素，比較了二者的物理性質(zhì)；采用紫外光譜法、紅外拉曼光譜法及場(chǎng)電鏡掃描法，確定了胞內(nèi)黑色素為DHN型黑色素，胞外黑色素為DOPA；設(shè)計(jì)了黑色素接種和毒素接種比較實(shí)驗(yàn)

9、，明確了玉米彎孢菌毒素是主要致病因子，黑色素聯(lián)合接種可使病原菌的致病性加大。 探討了玉米彎孢葉斑病菌黑色素的致病機(jī)理，初步研究了玉米彎孢菌Brnl基因表達(dá)與病原菌黑色素合成、病原菌致病性間的關(guān)系。黑色素接種實(shí)驗(yàn)表明，黑色素接種寄主后，寄主細(xì)胞質(zhì)膜透性無(wú)明顯變化，毒素接種后寄主細(xì)胞質(zhì)膜透性增加，而黑色素與毒素聯(lián)合接種后寄主細(xì)胞質(zhì)膜透性增加幅度增大，說(shuō)明毒素是病原菌致病的關(guān)鍵因子，黑色素影響致病性大小的關(guān)鍵因子；采用酶聯(lián)免疫分析及免

10、疫熒光電鏡觀察，確定了玉米彎孢菌黑色素存在于附著胞及侵染后擴(kuò)展的菌絲中，無(wú)黑色素存在的菌株無(wú)致病性；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和Northern blotting技術(shù)研究了黑色素合成受抑菌株及野生菌株在生長(zhǎng)相同階段的Brnl蛋白基因的表達(dá)差異，結(jié)果表明，在菌株黑色素合成受抑時(shí)，Brnl蛋白基因的表達(dá)弱，差異達(dá)極顯著；進(jìn)一步的接種實(shí)驗(yàn)證明，黑色素合成受抑，菌株的致病性明顯下降，由此說(shuō)明，玉米彎孢菌Brnl蛋白基因的表達(dá)與黑色素的生物合成、