菊花提取物效應(yīng)成分的代謝及動力學(xué)研究.pdf

1、菊花(Flos Chrysanthemi)為菊科菊屬植物菊(Chrysanthemum morifolium Ramat.)的頭狀花序。據(jù)《本草綱目》、《本草疏經(jīng)》記載,菊花具有疏散風(fēng)熱、明目、平肝潛陽、清熱解毒之功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,菊花提取物(Chrysanthemum morifolium extracts,CME)具有治療心血管系統(tǒng)疾病的作用。進(jìn)一步的研究證明,菊花提取物主要功效與其所含的黃酮類化合物密切相關(guān)。因此,系統(tǒng)研究

2、菊花中黃酮類化合物的體內(nèi)過程,特別是研究其效應(yīng)成分藥動學(xué)及其體內(nèi)外的吸收動力學(xué)特征,對于選擇合適的劑型、優(yōu)化給藥方案,具有重要的意義。研究表明,菊花提取物(CME)經(jīng)口給予后,體內(nèi)主要效應(yīng)成分為木犀草素和芹菜素。因此,本研究主要以木犀草素和芹菜素為研究對象,建立兩者的生物樣本分析方法,并用建立的HPLC方法考察不同動物經(jīng)口給予菊花提取物后,木犀草素和芹菜素的藥動學(xué)差別,并觀察其在不同動物腸道的吸收、腸道菌群的代謝和肝臟微粒體代謝等情況,

3、初步了解CME在不同種屬動物的吸收、代謝、排泄等方面的差異性,以期為該類藥物的開發(fā)提供新的思路和方法,并為臨床合理用藥和科學(xué)評價CME的動物藥效學(xué)、藥動學(xué)及毒理學(xué)提供重要依據(jù)。
　　第一章菊花提取物效應(yīng)成分的藥動學(xué)研究
　　1.菊花黃酮及其水解產(chǎn)物效應(yīng)成分在家兔體內(nèi)動力學(xué)研究
　　目的:建立兔血漿中木犀草素和芹菜素的HPLC分析方法,并比較家兔口服菊花提取物(CME)及其酸水解產(chǎn)物后血漿中效應(yīng)成分(木犀草素和芹菜素)的

4、濃度,計(jì)算其動力學(xué)參數(shù),從而闡明菊花黃酮不同給藥形式對其生物利用度和藥動學(xué)參數(shù)的影響。
　　方法：健康家兔灌胃CME及其酸水解產(chǎn)物(200 mg/kg，n=3)，于不同時間取血，肝素抗凝，離心得血漿，用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測定血漿中木犀草素和芹菜素的藥物濃度，3P87軟件擬合血漿藥物濃度．時間曲線，并計(jì)算藥動學(xué)參數(shù)，Microsoft Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果：家兔灌胃CME及其酸水解產(chǎn)物后

5、，血漿中木犀草素濃度較高，其藥代動力學(xué)過程符合一室模型，而血漿中芹菜素濃度在定量限以下。兩種形式給予家兔灌胃后，所得木犀草素藥代動力學(xué)參數(shù)表明：與原型CME比較，以其水解產(chǎn)物給家兔灌胃，木犀草素在其體內(nèi)的血藥濃度達(dá)峰時間Tmax略滯后，最高血藥濃度Cmax有所降低，而平均滯留時間MRT有所延長。但經(jīng)t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，兩種形式給藥，在家兔血漿的木犀草素濃度和AUC無顯著性差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：以原型CME或其水解產(chǎn)物給健康

6、家兔灌胃，即CME中黃酮類化合物以苷或苷元的形式給藥，藥動學(xué)特征無統(tǒng)計(jì)差異。
　　2．CME效應(yīng)成分在大鼠體內(nèi)的線性動力學(xué)研究
　　目的：研究CME效應(yīng)成分在大鼠體內(nèi)的動力學(xué)特征及考察其線性動力學(xué)的劑量范圍。
　　方法：SD大鼠（雄性）隨機(jī)單盲法灌胃不同劑量CME（100，200和400mg/kg及耐受劑量12 g/kg，n=5），于不同時間尾靜脈取血，離心得血漿，經(jīng)酸水解后HPLC測定血漿中總體木犀草素和芹菜素的藥物

7、濃度。
　　結(jié)果：大鼠灌胃lOOmg/kg CME后，血漿中木犀草素和芹菜素藥代動力學(xué)過程均符合一室模型，而灌胃200-400mg/kgCME后，兩者均符合二室模型；木犀草素和芹菜素在100-400mg/kg劑量范圍內(nèi)Cmax和AUCo-∞隨劑量的增加成線性增加：當(dāng)大鼠給予12g/kg的耐受劑量時，并未出現(xiàn)嚴(yán)重的不可逆的不良反應(yīng)。
　　結(jié)論：大鼠灌胃CME100-400mg/kg劑量范圍內(nèi)，效應(yīng)成分木犀草素和芹菜素呈線性動力

8、學(xué)過程，且在耐受劑量（12g/kg）以內(nèi)都有很好的安全性。
　　3．Beagle犬長期經(jīng)口給予菊花提取物后體內(nèi)動力學(xué)研究
　　目的：研究Beagle犬連續(xù)高低劑量經(jīng)口給予CME9個月后，木犀草素和芹菜素的代謝動力學(xué)特征。
　　方法：Beagle犬連續(xù)給藥CME(102和918mg/(kg-day)，n-3)
　　9個月后，不同時間隱靜脈取血，以HPLC測定血漿中總木犀草素和芹菜素濃度，并計(jì)算藥代動力學(xué)參數(shù)。

9、>　　結(jié)果：Beagle犬連續(xù)給予CME9個月后，血漿中木犀草素濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于芹菜素；經(jīng)3P87軟件模擬血漿藥時曲線，給918mg/(kg-day)CME時木犀草素和芹菜素的藥代動力學(xué)過程均符合一室模型，102mg/(kg-day)CME時兩者均符合二室模型：兩者的Cmax和AUCo-∞隨劑量的增加而增加，但與劑量不成
　　比例關(guān)系；連續(xù)給藥9個月后，木犀草素和芹菜素在犬體內(nèi)無累積現(xiàn)象出現(xiàn)。
　　結(jié)論：Beagle犬連續(xù)給藥C

10、ME(102和918mg/(kg.day》9個月后，大體上兩組動物并無顯著性差異，并且無嚴(yán)重不可逆的不良反應(yīng)產(chǎn)生。
　　4．CME效應(yīng)成分在人體內(nèi)的藥代動力學(xué)和尿藥排泄研究
　　目的：研究CME效應(yīng)成分在人體血漿和尿液的動力學(xué)過程以及了解兩者的尿液排泄率，為臨床合理用藥提供依據(jù)。
　　方法：健康志愿者(n=8)口服CME片 （20mg/kg）后，于不同時間取血并收集尿液，血漿經(jīng)酸水解，尿液經(jīng)β-葡萄糖醛酸酶/硫酸酯酶

11、水解后，RP-HPLC分別測定木犀草素和芹菜素的血藥及尿藥濃度，并計(jì)算兩者各自的尿藥總排泄率。
　　結(jié)果：健康志愿者口服CME片劑后，血漿中木犀草素和芹菜素的藥代動力學(xué)過程均符合二室模型，且兩者的Tmax都<1.0h：經(jīng)混合酶水解后，尿液中芹菜素濃度高于木犀草素，在12h內(nèi)兩者的尿藥總排泄率分別為2.30％和6.09%。
　　結(jié)論：健康志愿者口服CME片后，吸收較快，在血漿中藥物消除較緩慢，12h后人尿中木犀草素和芹菜素累積

12、排泄率較小，提示硫酸根或葡萄糖醛酸苷結(jié)合物僅占總代謝物的一小部分，或者尿液排泄不是CME代謝的主要途徑。
　　第二章菊花提取物腸道處置研究
　　1．腸道菌群對菊花提取物的代謝作用
　　目的：觀察和比較人、大鼠、Beagle犬及家兔腸道菌群對菊花提取物的代謝作用。
　　方法：健康人、大鼠、Beagle犬及家兔的新鮮糞便厭氧孵育液中加入一定量CME，置于37℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)，經(jīng)乙酸乙酯提取后以HPLC/LC-MS方

13、法對代謝成分進(jìn)行分離和定性定量分析。
　　結(jié)果：CME容易被腸道菌群代謝，經(jīng)LC-MS檢測，主要的代謝物為木犀草素和芹菜素；隨著代謝時間的延長，兩者均出現(xiàn)降解代謝現(xiàn)象；且人、大鼠和Beagle犬腸道菌對CME的代謝較快，而家兔腸道菌對CME的代謝過程比較平緩。
　　結(jié)論：在離體厭氧培養(yǎng)條件下，CME可以被人、大鼠、Beagle犬及家兔的腸內(nèi)菌代謝，主要的代謝物為木犀草素和芹菜素。
　　2．菊花提取物水解產(chǎn)物在動物外翻腸

14、囊的吸收動力學(xué)研究
　　目的：運(yùn)用外翻腸囊法研究和比較CME水解產(chǎn)物效應(yīng)成分木犀草素和芹菜素在不同種屬動物的腸吸收動力學(xué)過程。
　　方法：采用大鼠及家兔外翻腸囊為體外吸收模型，在Kreb氏溶液中于37℃水浴通混合氣體(95%C02+5%02)孵育一定時間后，采用HPLC法測定腸囊內(nèi)液中木犀草素和芹菜素的濃度，并用腸段表面積為校正因子，計(jì)算兩動物腸段的吸收速率常數(shù)(KR)和表觀滲透系數(shù)（Papp）。
　　結(jié)果：在大鼠和家

15、兔腸道中，木犀草素和芹菜素的吸收速率常數(shù)K。分別為：0.0185、0.0253min.1和0.0186、0.0091min-1；表觀滲透系數(shù)Papp分別為：3.941x10-5、1.051×l0-5cm/min和10.15X10-5、2.443×10-5cm/min。
　　結(jié)論：木犀草素和芹菜素在大鼠腸道比在家兔腸道吸收強(qiáng)，且芹菜素吸收強(qiáng)于木犀草素，這與體內(nèi)芹菜素Cmax高于木犀草素Cmax的藥動學(xué)結(jié)果相一致。經(jīng)t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，芹

16、菜素在兩種腸道的吸收具有顯著性差異(P<0.01)。
　　第三章菊花提取物在肝微粒體中的代謝研究
　　1.動物肝微粒體對CME水解產(chǎn)物的代謝作用
　　目的：研究和比較Beagle犬、家兔和大鼠肝微粒體對CME水解產(chǎn)物效應(yīng)成分芹菜素的代謝作用以及酶代謝動力學(xué)特征。
　　方法：鈣鹽沉淀法制備Beagle犬、家兔和大鼠肝微粒體后，10.μg/mL CME水解產(chǎn)物與肝微粒體酶(0.3-0.8mg/mL)在37℃水浴中孵育

17、不同時間(5-15min)后，用HPLC法測定孵育液中芹菜素的濃度，以選擇實(shí)驗(yàn)最佳酶蛋白濃度和孵育時間；不同濃度的CME水解產(chǎn)物(10.0-200μg/mL)與三種動物肝微粒體孵育一定時間后，測定孵育液中芹菜素的濃度，并用所測濃度與反應(yīng)速度做Lineweave-Brurk雙倒數(shù)曲線，推導(dǎo)出芹菜素在不同動物肝微粒體中的酶促動力學(xué)參數(shù)。
　　結(jié)果：當(dāng)Beagle犬、家兔和大鼠肝微粒體酶蛋白濃度分別為0.5mg/mL、0.3mg/mL和

18、0.3 mg/mL時，三種微粒體對芹菜素代謝的最佳孵育時間分別為10 min、5min和5min。芹菜素在Beagle犬、家兔和大鼠肝微粒體中代謝的Vm和Km分別為0.1970±0.010μg/mg/min和3.608±0.62μg/mL，0.8924±0.051μg/mg/min和4.363±0.46μg/mL，0.3274±0,061 μg/mg/min和3.599±0.62υg/mL。
　　結(jié)論：CME水解產(chǎn)物（10.0-2