殼聚糖-聚乙二醇琥珀酸酯絲裂霉素C釋藥系統(tǒng)的系列實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、椎板切除或開窗為脊柱外科常用的手術(shù)方法之一。在椎板切除術(shù)后，硬膜外瘢痕組織向椎管內(nèi)擠壓，牽拉硬脊膜及神經(jīng)根等病理過程是產(chǎn)生脊椎術(shù)后失敗癥候群的重要原因。脊椎術(shù)后失敗癥候群，并不全然是指手術(shù)本身失敗而言，在學(xué)術(shù)研究上更包括了凡是脊椎手術(shù)后癥狀仍然持續(xù)，或者再度發(fā)生新的癥狀之病癥。另外，也包括其他未經(jīng)手術(shù)的脊椎新的退化性椎間盤疾病，均統(tǒng)稱脊椎術(shù)后失敗癥候群。而脊椎術(shù)后失敗癥候群的病人，通常在手術(shù)后仍然持續(xù)出現(xiàn)背痛、坐骨神經(jīng)痛，甚至造成功能障

2、礙等癥狀。在眾多造成脊椎術(shù)后失敗癥候群之原因中，脊椎術(shù)后瘢痕組織的形成可視為一個(gè)重要的原因。脊椎術(shù)后瘢痕組織主要是由于手術(shù)中受到創(chuàng)傷的骨膜和脊旁肌群中的纖維母細(xì)胞侵入術(shù)后所殘留的血塊中，經(jīng)過一段時(shí)間逐漸轉(zhuǎn)化而成脊椎術(shù)后瘢痕組織，瘢痕組織沿著術(shù)后椎板缺口進(jìn)入脊柱管腔內(nèi)，并與脊椎管腔內(nèi)的神經(jīng)組織形成粘連，而此粘連不僅使得與之粘連的脊椎硬腦膜出現(xiàn)增厚，同時(shí)亦使馬尾內(nèi)的神經(jīng)根產(chǎn)生病理性變化，嚴(yán)重影響脊柱外科手術(shù)的遠(yuǎn)期效果，而且給再次手術(shù)帶來困難

3、。這勢(shì)必會(huì)延長(zhǎng)治療時(shí)間，增加患者的傷痛。因此，如何有效地預(yù)防術(shù)后硬膜外瘢痕粘連是脊柱外科領(lǐng)域亟待解決的課題。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)踐方面進(jìn)行了大量的研究，取得了一定的進(jìn)展。為此，我們與華南農(nóng)業(yè)大學(xué)制藥工程系合作研制一種新型的載藥緩釋膜片系統(tǒng)，并經(jīng)以下系列實(shí)驗(yàn)研究證明：這一新型緩釋膜片系統(tǒng)具有良好的生物相容性，可在局部緩釋絲裂霉素，有效地抑制脊柱術(shù)后硬膜外瘢痕的增生。實(shí)驗(yàn)分三個(gè)部分進(jìn)行觀察研究： 課題研究第一部分：殼

4、聚糖/聚乙二醇琥珀酸酯薄膜釋藥系統(tǒng)的制備及其與肌成纖維細(xì)胞生物相容性的研究。 目的：制備防粘連殼聚糖/聚乙二醇琥珀酸酯薄膜并觀察其在體外與肌成纖維細(xì)胞的生物相容性。 方法：實(shí)驗(yàn)于2006-05/12在南方醫(yī)科大學(xué)附屬珠江醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室完成。實(shí)驗(yàn)材料：在透析后的殼聚糖與聚乙二醇琥珀酸酯或聚乙二醇共混后置入凍干機(jī)凍干制得殼聚糖/聚乙二醇琥珀酸酯薄膜或殼聚糖/聚乙二醇膜，并將新生2～5 d的SD大鼠骨骼肌成纖維細(xì)胞種植于膜片上

5、。實(shí)驗(yàn)評(píng)估：①M(fèi)TT法測(cè)定肌成纖維細(xì)胞接種在不同膜片上12h的吸光光度值，計(jì)算相對(duì)貼附率。相對(duì)貼附率=不同膜的A<,490nm>/培養(yǎng)板的A<,490nm>×100％。②MTT法測(cè)定肌成纖維細(xì)胞在不同膜片上的生長(zhǎng)1，3，5 d后的吸光光度值。⑧相差顯微鏡下觀察肌成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)形貌。應(yīng)用SPSSl．3．0軟件對(duì)細(xì)胞貼附率結(jié)果行單項(xiàng)方差分析及LSD法兩兩比較和對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)情況行重復(fù)測(cè)量方差分析(α=0.05)。 結(jié)果：①肌成纖維細(xì)胞

6、在不同膜片上的貼附率：肌成纖維細(xì)胞在殼聚糖/聚乙二醇琥珀酸酯薄膜上能良好粘附、增殖，而在殼聚糖/聚乙二醇膜、殼聚糖膜上粘附性差。聯(lián)合培養(yǎng)12 h，5 d后MTT法結(jié)果顯示，殼聚糖/聚乙二醇琥珀酸酯組的A值分別為0.074±0.009，0.141±0.031，分別為殼聚糖組的6.17倍和6.13倍(P=0.000)。②肌成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)特性：肌成纖維細(xì)胞在殼聚糖/聚乙二醇琥珀酸酯膜上的活性最高，增殖能力最強(qiáng)，增長(zhǎng)速度最快，其次為殼聚糖/聚

7、乙二醇膜，但兩者比較差異有顯著性意義(P=0.046)，而細(xì)胞在殼聚糖膜上的增殖能力較低，膜上細(xì)胞數(shù)目較少，與其他組比較差異有顯著性意義(P=0.000)。⑧肌成纖維細(xì)胞與不同膜片聯(lián)合培養(yǎng)1，3，5 d時(shí)的生長(zhǎng)形貌：殼聚糖膜上細(xì)胞未貼壁生長(zhǎng)，為透明的圓球形，呈游離狀態(tài)，未能很好舒展，且有些皺縮，生長(zhǎng)活力也不旺盛；細(xì)胞與殼聚糖/聚乙二醇膜、殼聚糖/聚乙二醇琥珀酸酯膜片聯(lián)合培養(yǎng)的生長(zhǎng)情況要明顯好于殼聚糖膜，細(xì)胞相互融合成片，多呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞

8、間隙狹窄，緊密排列成束，成指紋狀結(jié)構(gòu)且聚集生長(zhǎng)的趨勢(shì)也更明顯。 結(jié)論：將接支琥珀酰基的聚乙二醇與殼聚糖共混組成的網(wǎng)狀系統(tǒng)改進(jìn)了膜片的力學(xué)性能，提高了膜片的柔韌性，使其成膜性更好；殼聚糖/聚乙二醇琥珀酸酯薄膜具有良好的生物相容性，肌成纖維細(xì)胞在殼聚糖/聚乙二醇琥珀酸酯薄膜上的粘附及生長(zhǎng)情況明顯好于殼聚糖薄膜。 課題研究第二部分：殼聚糖/聚乙二醇琥珀酸酯絲裂霉素C釋藥系統(tǒng)的研制與體外釋放實(shí)驗(yàn) 目的：研制殼聚糖/聚乙二

9、醇琥珀酸酯(Chitosan-Polyethlyeneglycols-Succinate，CH/PEG-SA)絲裂霉素C(Mitomytin C,MMC)局部藥物釋放系統(tǒng)，觀察其體外釋藥效果。 方法：體外釋藥測(cè)定藥物釋放濃度與時(shí)間的變化曲線，探討膜片結(jié)構(gòu)與釋藥的關(guān)聯(lián)性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，用回歸分析和曲線擬合絲裂霉素C標(biāo)準(zhǔn)品濃度與紫外吸收光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程。 結(jié)果：根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制的絲裂

10、霉素C標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線回歸方程為：y=0.593x<'3>-2.563x<'2>+25.944x-0.236，確定系數(shù)為1.000。藥物緩釋膜片3個(gè)試樣中絲裂霉素C均能從膜片向PBS液中擴(kuò)散，具有明顯緩釋作用。釋放量逐漸增加，于第12天時(shí)維持釋放量達(dá)最大，為14.9616μg/mL，其后又于第18天和第32天時(shí)出現(xiàn)兩次釋放高峰，分別為14.4824μg/mL和11.4092μg/mL，其余時(shí)間以較低濃度間斷釋放維持，且釋放量逐漸減少，于第

11、60天時(shí)三周累積釋放量仍有0.179μg/mL的釋放量，明顯高于成纖維細(xì)胞．50％抑制率質(zhì)量濃度(ID<,50>，10.4713μg/mL)。 結(jié)論：該膜片之所以能保持長(zhǎng)時(shí)間的藥物釋放，與它的結(jié)構(gòu)有關(guān)：CH/PEG-SA是在聚乙二醇的末端接支共聚琥珀酸，通過在聚乙二醇末端的羥基上引入羰基和羧基：HO-(CH<,2>CH<,2>O)n-H(聚乙二醇)+HOOCCH<,2>CH<,2>COOH(琥珀酸)→HOOC CH<,2>CH<

12、,2>COO-(CH<,2O)n-OCCH<,2>CH<,2>COOH。而MMC本身又有3個(gè)羰基結(jié)構(gòu)，利用羰基和羧基與殼聚糖分子中氨基間的分子作用力，既提高膜片的柔韌性，又改善復(fù)合材料的力學(xué)性能，使其成膜性更好，釋放性能更顯著，能更有效地避免藥物突釋，保持長(zhǎng)時(shí)間的藥物釋放。 課題研究第三部分：殼聚糖/聚乙二醇琥珀酸酯絲裂霉素C薄膜釋藥系統(tǒng)預(yù)防SD大鼠椎板切除術(shù)后硬膜外瘢痕粘連形成的實(shí)驗(yàn)研究 目的：研究殼聚糖

13、/聚乙二醇琥珀酸酯絲裂霉素C薄膜釋藥系統(tǒng)對(duì)硬膜外瘢痕粘連的治療作用。 方法：SD大鼠30只，隨機(jī)分為6組，每組5只。選用SD大鼠制作腰椎椎板切除模型，將30只SD大鼠稱重，按體重大小順序編號(hào)，按隨機(jī)數(shù)目表法隨機(jī)分為Ⅰ～Ⅵ組。Ⅰ組植入20mg CH膜片；Ⅱ組植入20mg CH/PEG膜片；Ⅲ組植入20mg CH/PEG-SA膜片；Ⅳ組用濃度為0.05mg/mLMMC溶液浸潤(rùn)5min；Ⅴ組植入20mg CH/PEG-SA/MMC膜片

14、；Ⅵ組無任何植入。治療術(shù)后4周取材，通過免疫組化、組織學(xué)檢查觀察比較硬膜外瘢痕的增生情況，應(yīng)用SPSS13.0軟件對(duì)大體觀察結(jié)果行多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)(Kruskal WaUis Test)檢驗(yàn)(α=0.05)；對(duì)免疫組化檢驗(yàn)結(jié)果單項(xiàng)方差分析(one-way ANOVA)及LSD法，以P<0.05為具有顯著性差異，比較上述各組方法對(duì)硬膜外瘢痕的治療作用。 結(jié)果：不同組膜片對(duì)硬膜外瘢痕粘連的大體觀察療效差異有顯著性意義(x<'2>=

15、24.120、P=0.000)。不同膜片組硬膜外瘢痕組織中羥脯氨酸含量比較有顯著性差異(F=12.085、P=9.000)，Ⅰ～Ⅴ組羥脯氨酸含量均低于Ⅵ組，有顯著性差異(P值分別為0.001、0.017、0.000、0.000、0.000)，說明各組均有抑制瘢痕組織增生的作用；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組三組比較，羥脯氨酸含量無顯著性差異(P值分別為0.177、0.880、0.136)，說明三組膜片對(duì)硬膜外瘢痕組織的抑制作用相當(dāng)；Ⅳ、Ⅴ組兩組比較，羥脯

16、氨酸含量無顯著性差異(P=0.654)，但與Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組比較均有顯著性差異(其中與Ⅳ組比較P值分別為0.032、0.001、0.045，與Ⅴ組比較P值分別為0.012、0.000、0.017)，說明該CH/PEG-SA/MMC膜釋藥系統(tǒng)與單獨(dú)用絲裂霉素C在抑制瘢痕的量上無顯著差別，但兩者的效果均好于其他組。 結(jié)論：①在椎板切除后，將CH/PEG-SA/MMC膜片植入椎板缺損處，能有效地減少硬膜外瘢痕中羥脯氨酸(Hyp)的含量，且

17、可以長(zhǎng)期釋放少劑量MMC，是抑制椎板切除術(shù)后硬膜外瘢痕粘連的理想方法，能達(dá)到減毒增效的作用。②傳統(tǒng)的單純局部應(yīng)用MMC方法雖然較對(duì)照組好且與CH/PEG-SA/MMC膜無顯著性差異，但不能確保長(zhǎng)期有效治療硬膜外瘢痕，且無法控制其短時(shí)間大劑量使用時(shí)本身的毒副作用。③單純局部應(yīng)用CH膜片僅起到機(jī)械屏障作用，有限地阻隔椎板后方瘢痕組織的侵入，但無法阻止炎癥過程中成纖維細(xì)胞向創(chuàng)口內(nèi)聚集、增殖、合成、分泌膠原纖維并形成瘢痕組織。 綜上所述