聚乙二醇-聚乳酸-絲裂霉素膠束的研制.pdf

1、本試驗旨在制備單甲氧基聚乙二醇．聚乳酸．絲裂霉素納米膠束并對其藥效學進行評價。首先制備了單甲氧基聚乙二醇，聚乳酸嵌段聚合物(mPEG-PLA)，并利用紅外光譜及H1NMR法對聚合物進行分析，確定聚合物的結(jié)構(gòu)并對其進行表征；再采用丙酮溶解揮發(fā)法制備mPEG-PLA-MMC納米膠束，納米膠束經(jīng)過0.45urn的微孔濾膜過濾除菌，將收集到的濾液經(jīng)冷凍干燥得到mPEG-PLA-MMC膠束固體。膠束的粒徑和形態(tài)采用透射電鏡、原子力顯微鏡進行表征；

2、利用紫外分光光度法測定mPEG-PLA-MMC納米膠束的包封率和載藥量；膠束粒子的納米載體效應即突釋、緩釋效應的測定采用紫外分光光度法：臨界膠束濃度(CMC)的測定采用的是熒光分光光度法；mPEG-PLA-MMC納米膠束的釋放研究采取以PBS為緩沖液、紫外分光光法測定；在體外試驗中，采用MTT法研究mPEG-PLA嵌段聚合物對MMC藥理作用的影響，主要實驗用細胞為人胃腺癌BGC-823細胞、人肝癌HepG2細胞；體內(nèi)試驗采用小鼠肉瘤$1

3、80和肝癌腹水瘤H22模型研究了mPEG-PLA-MMC納米膠束的藥理作用，將其結(jié)果與單使用MMC相比較，研究膠束藥物是否具有靶向性及是否對MMC的藥理作用具有增強作用。一、單甲氧基聚乙二醇，聚乳酸嵌段聚合物(m PEG-PLA)的制備及表征
　　 以單甲氧基聚乙二醇與D，L-丙交酯為原料，通過直接開環(huán)聚合反應制備mPEG-PLA嵌段聚合物。將mPEG與D，L．丙交酯置于真空干燥箱內(nèi)，于70℃、0.lmPa壓力下干燥2h。甲苯經(jīng)

4、蒸餾純化備用。將mPEG與D，L．丙交酯按照一定質(zhì)量比投入到密閉的三頸瓶內(nèi)，以辛酸亞錫為催化劑、氮氣保護條件下，140℃回流8h，反應結(jié)束得到單甲氧基聚乙二醇一聚乳酸嵌段聚合物(mPEG-PLA)粗產(chǎn)品，經(jīng)純化得到較純產(chǎn)品，顏色為白色或乳白色。嵌段聚合物的表征主要采取紅外光譜法及H1NMR分析。
　　 經(jīng)分析可以確定制備的樣品為單甲氧基聚乙二醇．聚乳酸嵌段聚合物(mPEG-PLA)。
　　 二、臨界膠束濃度(CMC)的測

5、定
　　 以熒光物質(zhì)芘為探針，可以測定mPEG-PLA嵌段聚合物的CMC值，隨著溶液中mPEG-PLA共聚物濃度的增加，芘的激發(fā)光強度增加，激發(fā)光波長逐漸紅移。當共聚物濃度達到CMC值以上時，部分芘進入膠束中，1338/333的比值發(fā)生明顯變化，因此可以通過這明顯變化的點來確定共聚物的CMC值。配制含有一定量芘的不同濃度的mPEG-PLA溶液，在熒光分光光度計下測定，結(jié)果顯示CMC值為1.9mg/L。
　　 三、mPEG

6、-PLA-MMC膠束的制備及表征
　　 1．mPEG-PLA-MMC膠束的制備：
　　 將mPEG-PLA嵌段聚合物與MMC按照不同的質(zhì)量比混溶于一定體積的丙酮溶液中，不斷攪拌使固體全部溶解。在通風櫥內(nèi)避光的條件下將溶液按照l滴/s的速度滴加到含有一定量三蒸水的燒杯內(nèi)，燒杯內(nèi)裝有磁力攪拌子，使滴下的溶液與三蒸水混合均勻，通風條件下使丙酮盡量揮發(fā)完全。一定時間后，取出溶液，將其轉(zhuǎn)移入經(jīng)事先處理的透析袋內(nèi)（透析袋的截留分子量

7、≥5000d），在恒溫水浴振蕩器內(nèi)透析，目的是使MMC游離出，而膠束得以保存。通過測定透析袋外的MMC的含量確定是否透析完全。等到透析結(jié)束，將透析袋內(nèi)的膠束轉(zhuǎn)移到經(jīng)滅菌的0.45um微孔濾膜，過濾除菌。濾液收集到經(jīng)高壓滅菌的玻璃器皿內(nèi)，于-20℃條件下預凍。預凍結(jié)束后將其轉(zhuǎn)移到冷凍干燥機內(nèi)，經(jīng)冷凍干燥制備膠束固體。制備的mPEG-PLA-MMC納米膠束在密封、避光、常溫條件下保存。
　　 2、膠束的粒徑、形態(tài)的表征
　　

8、 2.1、透射電鏡法
　　 透射電鏡(TEM)結(jié)果顯示：干燥膠束為球形微粒，可以形成核殼結(jié)構(gòu)。中間發(fā)亮的為密度較大的疏水性的核即PLA，外周淡淡的一層為親水性的mPEG?？瞻啄z束的粒徑在50nm左右，而載藥膠束的粒徑在80-100nm之間，粒徑分布較均勻。
　　 2.2、原子力顯微鏡法
　　 配制一定濃度的膠束溶液，超聲使其盡可能分離，以減少團聚現(xiàn)象。將超聲后的溶液滴加到新鮮剝離的、平整的云母表面，固定5rain

9、，用濾紙將溶液吸干，置于空氣中使其干燥完全。干燥完全后將樣品置于原子力顯微鏡下觀察測定。結(jié)果顯示：膠束的粒徑與透射電鏡結(jié)果相一致。
　　 2.3、紅外光譜法
　　 利用KBr壓片法，在紅外光譜儀中分析mPEG-PLA-MMC納米膠束、mPEG-PLA空白膠束及mPEG-PLA空白膠束與MMC物理混合三種不同樣品。通過比較紅外光譜圖，確定MMC確實存在于制備的復合物中。
　　 2.4、HlNMR法
　　 取

10、適量樣品，將其溶解到CH2DCC13中，將溶液轉(zhuǎn)移到核磁共振管內(nèi)，在400MHz條件下進行分析。通過比較mPEG-PLA-MMC納米膠束、mPEG-PLA空白膠束及mPEG-PLA空白膠束與MMC物理混合的核磁圖片，確定MMC存在于mPEG-PLA嵌段共聚合物中，即制備了需要的mPEG-PLA-MMC納米膠束。四、mPEG-PLA-MMC膠束載藥量及包封率的測定及緩釋研究
　　 在制備mPEG-PLA-MMC膠束的過程中，收集透

11、析袋外的溶液，測定其中的游離MMC的吸光度，將其帶入到MMC的標準曲線A=0.0042+0.0607"C(R=1.0000，P<0.0001)中，即可求得游離MMC的質(zhì)量。在總的MMC中減去游離MMC的質(zhì)量，即可求得mPEG-PLA-MMC膠束中MMC的質(zhì)量，利用下面公式求載藥膠束的載藥量及包封率。
　　 載藥量=載藥膠束中的MMC質(zhì)量×100％聚合物的質(zhì)量中MMC的MC的總質(zhì)
　　 經(jīng)計算當mPEG-PLA嵌段聚合物與

12、MMC的質(zhì)量比為10.3時，載藥膠束的載藥量和包封率較好，載藥量可達15%，包封率可達52%。
　　 稱取一定量的載藥膠束，將其溶解在一定體積的PBS中，將其轉(zhuǎn)移到經(jīng)事前處理的透析袋內(nèi)（截留分子量≥5000d），將其密封后置于裝有大量的PBS燒杯中，將燒杯置于恒溫水浴振蕩器內(nèi)，設定好溫度及速度，在預定的時間點及時更換固定量的新鮮PBS液體，直到利用紫外法無法檢測到MMC為止。將各次含量相累加后與所對應的時間點作圖，即可得到mPE

13、G-PLA-MMC膠束的突釋、緩釋效果圖。實驗結(jié)果表明，載藥膠束的突釋現(xiàn)象不明顯，而緩釋效果明顯，緩釋時間為18±ld。
　　 五、mPEG-PLA對MMC體外殺傷癌細胞作用的研究
　　 體外試驗旨在從體外的角度考察mPEG-PLA對MMC藥理作用的影響。采用MTT法通過測定抑瘤率證明mPEG-PLA對MMC殺傷細胞是否有影響。試驗中采用BGC-823細胞及Hepg2細胞作為實驗對象。實驗結(jié)果表明在體外mPEG-PLA嵌

14、段聚合物對MMC的活性無增強作用，相反在較低劑量下mPEG-PLA-MMC納米膠束的抗腫瘤活性較低，在高劑量下（2000ug/ml及以上）兩者無顯著差異。考慮到mPEG-PLA-MMC納米膠束的緩釋效果，此實驗結(jié)果的產(chǎn)生是合理的，低劑量下由于mPEG-PLA-MMC納米膠束釋放出的MMC較少，因此抑制作用較低，高劑量下MMC釋放量較多，當MMC達到一定量時，對細胞的抑制作用相對穩(wěn)定，所以兩者之間差異不顯著。
　　 六、mPEG-

15、PLA對MMC體內(nèi)抗腫瘤作用的影響及毒性研究
　　 體內(nèi)試驗通過對小鼠肉瘤Sl80模型抑瘤率和小鼠肝癌腹水瘤H22模型生命延長率的影響，觀察了mPEG-PLA嵌段聚合物在體內(nèi)對MMC的增效作用。毒性研究采用BABL/C小鼠，一系列劑量給藥，觀察組織損傷情況。
　　 1、小鼠肉瘤S180模型
　　 以小鼠肉瘤S180為試驗模型，mPEG-PLA嵌段聚合物可以顯著增加MMC在體內(nèi)的抗腫瘤作用。mPEG-PLA-MMC

16、納米膠束劑量為2、6、18mg/kg時對腫瘤的抑制作用為31.23%、51.78%、66.80%，而MMC劑量為lmg/kg時對腫瘤的抑制作用為34.78%。mPEG-PLA-MMC納米膠束中MMC的含量約為1/6，因此mPEG-PLA-MMC納米膠束為6mg/kg時與單使用MMCl mg/kg劑量相當。數(shù)據(jù)顯示：mPEG-PLA-MMC納米膠束劑量為2mg/kg時與單使用MMC劑量lmg/kg對腫痛的抑制作用相當，在中高劑量下對腫瘤的

17、抑制作用顯著增加，具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。
　　 2、小鼠肝癌腹水瘤H22模型
　　 以小鼠肝癌腹水瘤H22為試驗模型，mPEG-PLA-MMC納米膠束組能顯著延長荷瘤小鼠的生存時間，延長生命延長率。mPEG-PLA-MMC納米膠束劑量為2、6、18mg/kg時生命延長率分別為76.6%、171.0%、206.5%，而MMC劑量為lmg/kg時生命延長率為123.4%。數(shù)據(jù)顯示：mPEG-PLA-MMC納米膠束

18、劑量為2mg/kg時與單使用MMC劑量lmg/kg對生命延長率的作用低，兩者之間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0．Ol)，在劑量為6、18mg/kg時與單使用MMC劑量lmg/kg對小鼠生命延長作用顯著增加，具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　 3、局部組織損傷實驗
　　 試驗結(jié)果表明：mPEG-PLA-MMC納米膠束可以顯著降低MMC對組織的損．傷作用。mPEG-PLA-MMC納米膠束組在組織損傷出現(xiàn)的時間較MMC組晚，發(fā)