水溶性富勒烯衍生物合成及其輻射生物學(xué)效應(yīng)研究.pdf

1、在輻射損傷防護(hù)工作中，重要的措施是尋找有效輻射防護(hù)劑。然而，目前國內(nèi)外已有的輻射防護(hù)劑還不理想，主要問題是防護(hù)效價(jià)低、毒副作用多，而且主要針對γ射線所致的輻射損傷，對高LET的中子照射和γ射線所致復(fù)合輻射損傷的防護(hù)效果很差。 電離輻射對生物體構(gòu)成損傷，主要來自兩方面的作用：一是輻射能量傳遞的直接作用，二是間接作用。電離輻射造成的生物體損傷主要是由于其間接作用引起的。輻射防護(hù)劑研究的主要思路是從緩解和阻斷輻射所致大量自由基的間接作

2、用，從而提高機(jī)體抗放能力。因此，清除自由基成為輻射防護(hù)研究的重點(diǎn)。 富勒烯是由60個(gè)碳原子組成中空籠狀結(jié)構(gòu)的碳的第三種同素異型體。實(shí)驗(yàn)證明超氧化物游離基被多羥基富勒醇俘獲，俘獲效率可高達(dá)85％。已有研究表明富勒烯及其衍生物吸收自由基，保護(hù)缺血再灌注對人神經(jīng)細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞的損傷，保護(hù)紫外線對人角化細(xì)胞損傷。 盡管富勒烯被喻為“吸收游離基的海綿”，但由于富勒烯水溶性很低，阻礙了其在生物學(xué)上的應(yīng)用，解決富勒烯水溶性的方案以往

3、主要有以下三種措施：①制備富勒烯水溶性包結(jié)物；②制備富勒烯水溶膠；③在富勒烯碳籠上添加水溶性基團(tuán)，合成制備富勒烯的水溶性衍生物。三種方法中以制備水溶性富勒烯衍生物最具有前景。 本課題首先合成制備富勒烯衍生物，研究該衍生物清除自由基的能力及其規(guī)律。之后，評價(jià)該衍生物對細(xì)胞的毒性作用，選出水溶性富勒烯安全使用濃度。觀察分析富勒烯衍生物對γ射線照射后細(xì)胞活力的變化，初步闡明富勒烯對細(xì)胞的輻射保護(hù)作用，為研制基于富勒烯為背景的新型輻射防

4、護(hù)劑提供前期基礎(chǔ)研究。 一、研究內(nèi)容： 1.合成制備功能化水溶性富勒烯衍生物。設(shè)計(jì)在富勒烯基團(tuán)上添加各種不同的衍生基團(tuán)，提高富勒烯的親水性。嘗試：①丙二酸與二甲基氨基丙胺通過DCC羧合，以1-HOBT作為消旋劑方案；②丙二酰氯與二甲基丙胺的直接反應(yīng)；③丙二酸二乙酯與二甲基氨基丙胺的胺解反應(yīng)，合成N1，N3-bis(3-(dimethylamino)propyl)malonamide。嘗試酰胺的溴化，通過NaH或者DBU做

5、堿，與富勒烯合成目標(biāo)化合物，以及合成酰胺通過DBU做堿，CBr4作為自由基直接合成目標(biāo)化合物兩種實(shí)驗(yàn)方案，優(yōu)化選擇后一種實(shí)驗(yàn)方案作為合成目標(biāo)化合物的實(shí)驗(yàn)方案。合成化合物通過氫譜，碳譜，質(zhì)譜以及紫外做出表征。同時(shí)合成目前合成技術(shù)成熟，水溶性較好，具備一定清除自由基能力的羧酸富勒烯衍生物C3。 2.研究水溶性富勒烯對自由基的清除能力。通過spin-tranping合并應(yīng)用ESR研究化合物對羥自由基的清除效果。檢測不同濃度富勒烯衍生物

6、C3對芬頓體系產(chǎn)生的羥自由基的清除能力，求出特征值，尋找作用規(guī)律和最適條件。 3.評價(jià)該富勒烯衍生物對細(xì)胞的毒性影響通過臺盼蘭拒染實(shí)驗(yàn)及PI單染檢測富勒烯羧酸衍生物對細(xì)胞毒性及細(xì)胞增殖活力變化的影響。觀察不同濃度富勒烯衍生物對細(xì)胞的毒性效應(yīng)，從中確定無毒性作用，或者幾乎無影響，同時(shí)又具有很強(qiáng)自由基清除作用的合適濃度，為下述各項(xiàng)生物學(xué)研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 4.探索富勒烯衍生物對細(xì)胞的輻射防護(hù)效應(yīng)。選取合適的細(xì)胞株，細(xì)胞與一定

7、濃度的富勒烯衍生物共孵育，觀察：①不同富勒烯衍生物濃度，對γ射線照射的保護(hù)作用。②相同富勒烯衍生物濃度對不同照射劑量的保護(hù)作用，③相同富勒烯衍生物濃度，照前照后不同時(shí)間加藥對細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)。④相同濃度，相同照射條件對不同細(xì)胞系的輻射防護(hù)作用。 二、結(jié)果 1.新型富勒烯衍生物的合成富勒烯的水溶性很低，嚴(yán)重阻礙了富勒烯生物學(xué)利用。我們利用打開富勒烯碳籠上的雙鍵，通過Bingle加成反應(yīng)添加水溶性基團(tuán)，合成富勒烯衍生物。分別嘗

8、試3種實(shí)驗(yàn)方案，優(yōu)化選擇通過丙二酸二乙酯和二甲基氨基丙胺胺解合成前體化合物N1，N3-bis(3-(dimethylamino)propyl)malonamide，通過Bingle1+2反應(yīng)將衍生基團(tuán)添加到富勒烯上生成富勒烯衍生物，通過堿性氧化鋁柱層析得到產(chǎn)物。 所生成的化合物通過氫譜(1H-NMR)、碳譜(13C-NMR)、紫外(UV-vis)以及質(zhì)譜(ESI)確定其為目標(biāo)化合物，建立了富勒烯單加合物合成技術(shù)平臺。我們還參考文

9、獻(xiàn)，合成目前技術(shù)相對成熟，水溶性較好羧酸富勒烯衍生物C3. 2.羧酸富勒烯衍生物C3清除自由基能力的研究：羥自由基是生物體系中活性最強(qiáng)的自由基，研究合成目標(biāo)化合物對羥自由基的清除效應(yīng)可以從一個(gè)側(cè)面衡量富勒烯的輻射防護(hù)效應(yīng)。DMPO作為自旋捕捉劑，研究合成目標(biāo)化合物對芬頓體系產(chǎn)生的羥自由基的清除效果。結(jié)果顯示當(dāng)富勒烯衍生物濃度為1mg/ml時(shí)，對3mM亞鐵離子芬頓體系產(chǎn)生的羥自由基的清除率為93％。 3.羧酸富勒烯衍生物的

10、放射生物學(xué)效應(yīng)初步探討：選取水溶性富勒烯羧酸衍生物C3(以下簡稱C3)，進(jìn)行生物學(xué)效應(yīng)研究。1).C3對細(xì)胞存活率和增殖的影響 通過臺盼蘭拒染技術(shù)，研究了C3對細(xì)胞存活率的影響。實(shí)驗(yàn)表明，C3濃度在0-400μg/ml范圍內(nèi)并沒有明顯的降低AHH-1的活存率(P＞0.05)。通過PI染色檢測C3對細(xì)胞凋亡的影響，C3濃度1-1000μg/ml時(shí)，C3與AHH-1細(xì)胞共同孵育2h，12h，48h，細(xì)胞凋亡率沒有顯著變化。這些結(jié)果說

11、明羧酸富勒烯衍生物C3對細(xì)胞毒性較低。 C3與人淋巴母細(xì)胞AHH-1共同孵育48小時(shí)后，C3濃度在0-100μg/ml范圍內(nèi)，對細(xì)胞增殖存在一定的抑制效應(yīng)，并呈劑量依賴性；而C3濃度在100-400μg/ml范圍內(nèi)雖仍然對細(xì)胞增殖有抑制效應(yīng)，但是并沒有進(jìn)一步提高富勒烯的增殖抑制效果(P＞0.05)。說明富勒烯對細(xì)胞的增殖抑制作用可能存在一定的效應(yīng)閾值。2).C3對輻照細(xì)胞存活率和凋亡率的影響 照前2h使用不同濃度的C3與

12、人淋巴母細(xì)胞AHH-1孵育，4Gy照射，臺盼蘭拒染實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞生長分?jǐn)?shù)和細(xì)胞存活率的變化，以及通過PI單染檢測細(xì)胞凋亡的變化。結(jié)果表明C3在10μg/ml時(shí)即可提高細(xì)胞的生長分?jǐn)?shù)，當(dāng)C3濃度提高為400μg/ml時(shí)仍可以提高細(xì)胞的生長分?jǐn)?shù)；但是濃度過高，達(dá)到600μg/ml時(shí)，細(xì)胞的生長分?jǐn)?shù)反而下降。 C3可以明顯的提高照后人淋巴母細(xì)胞的存活率。在200-400μg/ml時(shí)，其保護(hù)效率很高，細(xì)胞存活率接近未照射組細(xì)胞水平。PI單

13、染檢測細(xì)胞凋亡的變化，得到與臺盼蘭拒染實(shí)驗(yàn)類似的結(jié)果，C3濃度在10-200μg/ml范圍內(nèi)，可以降低輻照細(xì)胞的凋亡率，呈藥物濃度依賴性；當(dāng)富勒烯羧酸衍生物濃度達(dá)到200μg/ml時(shí)，凋亡細(xì)胞的比例下降為10.49±0.53％，接近未照射組細(xì)胞(8.6±0.75％)水平，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于未用藥照射對照組凋亡細(xì)胞的比例(26.30±0.74％)，兩者差別非常顯著(P＜0.01)。說明照前給藥，富勒烯羧酸衍生物可以較好的保護(hù)人淋巴母細(xì)胞。

14、研究還發(fā)現(xiàn)，照前，照后加入200μg/ml濃度的富勒烯羧酸衍生物與AHH-1共孵育后，C3對相同劑量照射的細(xì)胞都存在著一定的保護(hù)作用。照前給藥，可以較明顯地降低細(xì)胞的死亡率和凋亡率，單純照射組細(xì)胞存活率約為80％，照前給藥組可以提高到89-91％；照后給藥也可以小幅度的提高照射細(xì)胞的細(xì)胞存活率，照后給藥組可以提高至83％-84％，降低凋亡比例，但比起照前給藥組提高效果相差較多。同時(shí)研究表明C3對不同細(xì)胞系都存在一定的保護(hù)效應(yīng)。

15、3、討論輻射引發(fā)的生物效應(yīng)，輻射對機(jī)體的損傷，主要通過間接作用。間接作用主要是通過水的原發(fā)輻射產(chǎn)物如：H.，0H.，e.aq，H202等自由基對生物大分子的作用，引起后者的損傷。目前輻射防護(hù)研究主要集中在使用自由基清除劑，清除電離輻射所致的自由基，從而達(dá)到輻射防護(hù)的目的。 富勒烯及其衍生物的6-6鍵是化學(xué)修飾反應(yīng)活性位；由于C60分子中除碳原子外沒有其它原子，所有C-C鍵都固定在球殼表面，它不可能發(fā)生取代反應(yīng)。富勒烯有低能量的L

16、UMO軌道，電子親合勢為2.65eV，循環(huán)伏安法測定它最多可以接受6個(gè)電子，反應(yīng)中表現(xiàn)出缺電子烯烴的性質(zhì)；它可以發(fā)生氧化還原、親核加成、[n+2]環(huán)加成等反應(yīng)；所以能夠大量清除氧自由基?？墒歉焕障┑乃苄院艿停瑖?yán)重阻礙了富勒烯生物學(xué)利用。合成制備水溶性的富勒烯衍生物，清除射線所產(chǎn)生自由基，從而從源頭抑制射線所產(chǎn)生的間接作用，保護(hù)生物組織，可以用于開發(fā)新型輻射防護(hù)劑。 本課題通過打開富勒烯碳籠上的雙鍵和加成反應(yīng)，在富勒烯碳籠上添加

17、水溶性基團(tuán)，通過Bingle1+2反應(yīng)將衍生基團(tuán)添加到富勒烯上生成新型富勒烯衍生物，還合成了水溶性較好羧酸富勒烯衍生物C3，建立了富勒烯單加合物合成技術(shù)平臺。 羧酸富勒烯C3水溶性比較高，DuganLL等研究表明其可以清除自由基保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)研究表明富勒烯羧酸衍生物C3對自由基存在比較好的清除效果，這一特性預(yù)示富勒烯羧酸衍生物C3可能對電離輻射存在比較好的輻射防護(hù)效應(yīng)，這在我們的研究中得到初步證實(shí)，它可以顯著降低輻照細(xì)胞的