鑒別犬瘟熱病毒強(qiáng)毒株和弱毒株的復(fù)合RT-nPCR方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、犬瘟熱 (Canine distemper,CD) 是由犬瘟熱病毒 (Canine distemper virus,CDV) 感染犬或其它食肉目動(dòng)物引起的一種高度接觸傳染性、致死性疾病,CDV屬于副粘病毒科麻疹病毒屬,該屬成員還包括麻疹病毒(MV)和牛瘟病毒(RPV).CDV是負(fù)鏈單股不分節(jié)段的RNA病毒,基因組全長15690nt,主要由N基因,P基因,M基因,F基因,H基因,L基因組成,只有一個(gè)血清型. 本研究旨在建立一種能區(qū)分CDV

2、強(qiáng)毒株、弱毒株的復(fù)合RT-nPCR的檢測方法.根據(jù)GenBank上登錄的所有CDV基因組全序列,選擇CDV強(qiáng)、弱毒株間有差異區(qū)域,選擇其高度保守區(qū)設(shè)計(jì)了一對通用引物Pl和P4,并在該對引物跨越區(qū)域的內(nèi)部設(shè)計(jì)了CDV強(qiáng)毒株特異性引物P2及弱毒株的特異性引物P3,用引物P1/P4進(jìn)行RT-PCR,然后用引物P2/P3/P4進(jìn)行復(fù)合套式PCR,建立了一種能區(qū)分CDV強(qiáng)、弱毒株的復(fù)合RT-nPCR的鑒別診斷方法.應(yīng)用該方法從CDV強(qiáng)、弱毒株的基

3、因組中分別擴(kuò)增出了大小為247bp和177bp的特異性片段,從兩種病毒基因組混合物中擴(kuò)增出了大小為247bp和177bp的兩條特異性片段,與犬細(xì)小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV)、犬冠狀病毒(CCV)、狂犬病病毒(RV)、新城疫病毒(NDV)的細(xì)胞培養(yǎng)物,以及正常細(xì)胞對照組進(jìn)行復(fù)合RT-nPCR擴(kuò)增時(shí)均為陰性.該方法敏感性為可以檢測到相當(dāng)于1×10<'-1>TCID<,50>的病毒RNA.檢測耗時(shí)短,最快可在6h內(nèi)完成.對從黑龍江省及

4、吉林省采集的30份疑似CD病料(分別來自于犬、狐、貉的脾臟、肝臟、肺臟、膀胱)進(jìn)行了檢測,結(jié)果表明,有20份為CDV,其中15份為CDV強(qiáng)毒株,5份為CDV弱毒株. 選擇2株復(fù)合RT-nPCR檢測為強(qiáng)毒的樣品(HLJ-1、HLJ-2)與GenBank中其余25株具有代表性的CDV毒株進(jìn)行H基因序列分析,結(jié)果顯示,復(fù)合RT-nPCR的檢測結(jié)果是準(zhǔn)確的;并且目前CDV各病毒株之間由于地域性及年代的不同,主要可區(qū)分為強(qiáng)毒株與弱毒株兩個(gè)

5、基因型,其中強(qiáng)毒株又可分為亞洲1型(Asia-1)、亞洲2型(Asia-2)、歐洲型(Europe)、美國型(USA)、北極型(Arctic)等五種基因型.我國有3株流行野毒 (giant panda、TN、Guizhou)屬于 Asia-1型,l株流行野毒 (Liu) 屬于 Arctic型,HLJ-1、HLJ-2均屬于Asia-2型. 本研究建立的復(fù)合RT-nPCR可以檢測CDV感染,并能作為強(qiáng)毒株、弱毒株的鑒別診斷方法,可用