腺病毒介導(dǎo)的LIGHT聯(lián)合白細(xì)胞介素12治療小鼠轉(zhuǎn)移性乳腺癌及其免疫機(jī)理研究.pdf

1、乳腺癌是危害婦女健康的主要惡性腫瘤，其發(fā)生率和死亡率僅次于肺癌。 利用具有抗腫瘤作用的細(xì)胞因子進(jìn)行基因治療在很多動(dòng)物模型中取得了較好的抗腫瘤效果。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，白細(xì)胞介素(IL-12，IL-2)，IFN-γ，GM-CSF等細(xì)胞因子可以通過(guò)增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞免疫功能作用而清除腫瘤。 白細(xì)胞介素12(IL-12)是天然免疫和獲得性免疫中重要的細(xì)胞因子，具有抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的生物學(xué)功能。它是由p35和p40兩個(gè)亞基組成的二聚體，主

2、要由巨噬細(xì)胞，樹(shù)突狀細(xì)胞，中性粒細(xì)胞等分泌。IL-12能夠誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的增殖活化，增強(qiáng)它們的細(xì)胞毒性并促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子特別是IFN-γ的分泌，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。 單獨(dú)應(yīng)用一些具有抗腫瘤作用的細(xì)胞因子如IL-12，GM-CSF等進(jìn)行基因治療雖然能有效地誘導(dǎo)抗腫瘤效應(yīng)，但它們的效果比較局限，一般只能在一定程度上局部抑制腫瘤的生長(zhǎng)，對(duì)于已經(jīng)惡性生長(zhǎng)的腫瘤，特別是具有高轉(zhuǎn)移特性的惡性腫瘤，這種單獨(dú)細(xì)胞因子基因療法很難達(dá)到理

3、想的效果。選擇相互間有協(xié)同免疫調(diào)節(jié)作用和抗腫瘤作用的細(xì)胞因子，進(jìn)行聯(lián)合基因治療，是腫瘤細(xì)胞因子基因治療的一個(gè)發(fā)展方向。 來(lái)源于BALB/c小鼠的4T1乳腺癌細(xì)胞與人類的乳腺癌細(xì)胞比較接近，具有低免疫原性和高轉(zhuǎn)移性，可轉(zhuǎn)移到肺，肝，淋巴結(jié)，骨髓及神經(jīng)系統(tǒng)。嚴(yán)重的肺轉(zhuǎn)移通常是導(dǎo)致荷瘤小鼠死亡的主要原因。當(dāng)腫瘤形成時(shí)，外科摘除腫瘤并不能顯著減小肺部轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)性，因此，這種腫瘤模型適合抗腫瘤轉(zhuǎn)移基因治療方面的研究。 本文的主要目

4、的在于研究腺病毒介導(dǎo)的LIGHT聯(lián)合IL-12的抗腫瘤作用及其免疫機(jī)理探討，觀察其對(duì)小鼠4T1乳癌和轉(zhuǎn)移的治療作用以及長(zhǎng)期免疫保護(hù)作用。我們建立了BALB/c小鼠高轉(zhuǎn)移乳腺癌4T1模型，應(yīng)用LIGHT(AdLIGHT)聯(lián)合IL-12(AdIL-12)的重組腺病毒進(jìn)行瘤內(nèi)注射取得了顯著的抗腫瘤治療效果。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與單獨(dú)的AdLIGHT或AdIL-12治療相比，聯(lián)合兩種分子，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生了更強(qiáng)的特異性和非特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)，荷瘤小鼠腫瘤的

5、生長(zhǎng)受到了抑制并最終消退，日誘發(fā)了長(zhǎng)期的免疫保護(hù)反應(yīng)。此外，這種聯(lián)合療法還抑制了腫瘤細(xì)胞的肺和肝轉(zhuǎn)移，顯著提高了小鼠的生存率并延長(zhǎng)了生存時(shí)間，提示聯(lián)合AdLIGHT和AdIL-12可能在基因治療轉(zhuǎn)移性的惡性腫瘤方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。 本研究分為體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)兩部分： 第一部分：LIGHT和IL-12的重組腺病毒對(duì)4T1細(xì)胞的感染及其生物學(xué)活性的鑒定 我們首先用重組腺病毒AdLIGHT，AdIL-12及對(duì)照病毒A

6、dLacZ感染4T1細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)了LIGHT和IL-12(IL-12p35，IL-12p40)在mRNA水平上的表達(dá)，用ELISA法和FACS檢測(cè)了LIGHT和IL-12在蛋白水平上的表達(dá)。結(jié)果顯示，腺病毒攜帶的LIGHT和IL-12能在4T1細(xì)胞中高效表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在抗小鼠CD3存在的情況下，感染了AdLIGHT或AdIL-12的4T1細(xì)胞能夠有效刺激T淋巴細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)IFN-γ的分泌，且AdLIGHT和Ad

7、IL-12具有協(xié)同刺激T淋巴細(xì)胞增殖的作用，說(shuō)明，感染AdLIGHT或AdIL-12的4T1細(xì)胞所表達(dá)的IL-12或LIGHT具有生物學(xué)活性。此外，AdLIGHT和AdIL-12腺病毒還誘導(dǎo)了部分4T1細(xì)胞的凋亡。 第二部分：腺病毒介導(dǎo)的LIGHT聯(lián)合IL-12對(duì)小鼠4T1乳癌的抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移作用及其免疫機(jī)理研究 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4T1細(xì)胞，注射至BALB/c小鼠右腹部皮下，建立4T1高轉(zhuǎn)移乳腺癌模型，隨機(jī)分組后，分別瘤

8、內(nèi)注射腺病毒AdLIGHT,AdIL-12，AdLIGHT/IL-12進(jìn)行治療，并設(shè)PBS和AdLacZ為對(duì)照組。 我們用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤大小并觀察荷瘤小鼠的生存期。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與PBS和AdLacZ對(duì)照組相比，單獨(dú)應(yīng)用AdLIGHT或AdIL-12進(jìn)行治療，抑制了腫瘤的生長(zhǎng)并延長(zhǎng)了荷瘤小鼠的生存期，兩組分別有28.6％和42.9％的小鼠腫瘤消退并得到了長(zhǎng)期存活(＞90天)。聯(lián)合AdLIGHT和AdIL-12進(jìn)行治療，不僅顯著抑制

9、了腫瘤的生長(zhǎng)，而且促進(jìn)了腫瘤的消退，延長(zhǎng)了小鼠的生存期。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療增強(qiáng)了小鼠脾細(xì)胞的NK和CTL殺傷活性并誘導(dǎo)了更多的Th1細(xì)胞因子(IL-2，IFN-γ)的分泌。提示機(jī)體被有效誘導(dǎo)產(chǎn)生了特異性和非特異性的抗腫瘤免疫反應(yīng)。 為了檢測(cè)聯(lián)合AdLIGHT和AdIL-12治療是否誘導(dǎo)了小鼠長(zhǎng)遠(yuǎn)性的保護(hù)性免疫力，我們將長(zhǎng)期存活小鼠分為兩組，在左腹皮下分別接種4T1細(xì)胞或CT26腸癌細(xì)胞并同時(shí)以未經(jīng)任何處理的小鼠作為對(duì)照組，分

10、別皮下接種同數(shù)量的4T1細(xì)胞或CT26細(xì)胞，觀察每組小鼠成瘤比率和存活時(shí)間。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合AdLIGHT和AdIL-12治療誘發(fā)小鼠產(chǎn)生了針對(duì)4T1細(xì)胞的保護(hù)性免疫，同時(shí)也產(chǎn)生了對(duì)CT26細(xì)胞的部分保護(hù)作用。 炎性細(xì)胞對(duì)腫瘤的浸潤(rùn)和腫瘤組織的壞死有利于機(jī)體對(duì)腫瘤的清除。腫瘤組織病理切片顯示，伴隨著瘤內(nèi)和瘤周炎性細(xì)胞(中性粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞)中等程度的浸潤(rùn)，AdLIGHT或AdIL-12單獨(dú)治療組腫瘤存在一定程度的壞死。在AdLIG

11、HT和AdIL-12聯(lián)合治療組，瘤周和瘤內(nèi)的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)最多，有大約2/3的腫瘤組織存在著嚴(yán)重的壞死。 我們進(jìn)一步用半定量PCR的方法檢測(cè)了腫瘤組織中趨化因子CCL21，IP-10，Mig的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CCL21可表達(dá)在AdLIGHT或AdLIGHT/IL-12治療組的腫瘤組織，而在對(duì)照組和AdIL-12治療組則不表達(dá)，說(shuō)明瘤內(nèi)注射AdLIGHT誘導(dǎo)了CCL21的表達(dá)。IP-10和Mig可表達(dá)在AdLIGHT或AdIL-

12、12單獨(dú)治療組，但它們?cè)诼?lián)合治療組的表達(dá)量最高，提示聯(lián)合應(yīng)用AdLIGHT和AdIL-12，可能通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤組織表達(dá)更多的IP-10和Mig，從而發(fā)揮趨化T淋巴細(xì)胞和抑制腫瘤血管形成的抗腫瘤作用。 4T1乳腺癌具有很高的全身轉(zhuǎn)移特性，特別對(duì)肺組織的轉(zhuǎn)移，通常是導(dǎo)致荷瘤小鼠死亡的主要原因。我們首先用腫瘤細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組荷瘤小鼠的肺轉(zhuǎn)移情況，將肺組織制成細(xì)胞懸液，加入6-巰鳥(niǎo)嘌呤培養(yǎng)10到12天后，對(duì)6-巰鳥(niǎo)嘌呤不敏感的4T

13、1細(xì)胞可以繼續(xù)生長(zhǎng)并形成細(xì)胞集落，而其他細(xì)胞則在6-巰鳥(niǎo)嘌呤的作用下死亡，甲醇固定細(xì)胞后用0.03％亞甲基藍(lán)染色，顯微鏡下可計(jì)算各組轉(zhuǎn)移到肺組織的4T1細(xì)胞克隆形成數(shù)。結(jié)果顯示，在PBS和AdLacZ對(duì)照組，有大量4T1細(xì)胞克隆集落形成，而AdLIGHT或AdIL-12單獨(dú)治療組形成的克隆集落明顯減少，在聯(lián)合治療組未檢測(cè)到細(xì)胞克隆的形成。提示聯(lián)合AdLIGHT和AdIL-12進(jìn)行治療，抑制了乳腺癌細(xì)胞對(duì)肺組織的轉(zhuǎn)移。肺組織的印度墨水染色

14、和病理切片分析進(jìn)一步證實(shí)了以上結(jié)論。 我們?cè)赥細(xì)胞缺陷的BALB/c裸鼠中觀察了AdLIGHT/IL-12對(duì)4T1乳腺癌的治療效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未治療組相比，AdLIGHT/IL-12只在一定程度上抑制了腫瘤的生長(zhǎng)，但不能促進(jìn)腫瘤的消退。缺少T淋巴細(xì)胞，顯著降低了AdLIGHT/IL-12的抗腫瘤作用。提示T淋巴細(xì)胞在AdLIGHT/IL-12抗腫瘤效應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用。我們進(jìn)一步用NK細(xì)胞剔除實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在AdLIGHT/IL

15、-12治療4T1乳腺癌模型中，NK細(xì)胞也是發(fā)揮重要作用的效應(yīng)細(xì)胞。 結(jié)論：1.腺病毒介導(dǎo)的LIGHT和IL-12基因能在4T1乳腺癌細(xì)胞中高效表達(dá)，表達(dá)的LIGHT和IL-12具有刺激T淋巴細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)IFN-γ分泌的能力。 2.在小鼠4T1乳腺癌模型中，聯(lián)合AdLIGHT和AdIL-12進(jìn)行瘤內(nèi)注射治療，顯著抑制了腫瘤的生長(zhǎng)并最終促進(jìn)其消退，接受聯(lián)合治療的小鼠可以長(zhǎng)期存活。3.聯(lián)合AdLIGHT和AdIL-12治療有

16、效抑制了腫瘤的肺和肝轉(zhuǎn)移。 4.AdLIGHT和AdIL-12聯(lián)合治療誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了針對(duì)4T1乳腺癌的長(zhǎng)遠(yuǎn)性保護(hù)性免疫，同時(shí)也誘導(dǎo)出了針對(duì)CT26腸癌細(xì)胞的部分保護(hù)性免疫。 5.聯(lián)合AdLIGHT和AdIL-12治療增強(qiáng)了小鼠脾細(xì)胞的NK和CTL殺傷活性并誘導(dǎo)了更多的Th1細(xì)胞因子(IL-2，IFN-γ)的分泌，誘導(dǎo)機(jī)能產(chǎn)生了特異性和非特異性的抗腫瘤免疫反應(yīng)。T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞是AdLIGHT/IL-12抗腫瘤效應(yīng)中的