白細胞介素27抑制肥大細胞介導的免疫反應及其機制研究.pdf

1、本文分為以下兩個部分進行探討：
　　第一部分 接頭蛋白TAB2信使RNA通過microRNA-155調(diào)節(jié)巨噬細胞內(nèi)毒素耐受
　　競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNAs，ceRNA)是近幾年新提出的一種RNA轉(zhuǎn)錄體之間的一種新的調(diào)控方式。擁有共同microRNA反應元件的RNA轉(zhuǎn)錄體通過競爭結合共同的microRNA從而調(diào)控彼此的翻譯。已有研究表明，ceRNA的調(diào)節(jié)方式參與多種基因?qū)δ[瘤發(fā)生的調(diào)控

2、過程。但是ceRNA的調(diào)節(jié)機制是否在天然免疫應答和內(nèi)毒素耐受中發(fā)揮作用尚未報道。脂多糖(LPS)刺激巨噬細胞會上調(diào)microRNA-155(miR-155)的表達，在內(nèi)毒素耐受過程中發(fā)揮作用，miR-155可以靶向LPS-TLR4信號通路中的多個分子，包括MyD88，TAB2，SOCS1，β-arrestin2和SHIP1等。我們檢測了在LPS刺激巨噬細胞后，上述幾個分子的表達豐度及其變化。發(fā)現(xiàn)TAB2 mRNA是在上述分子中表達最高的

3、，也是變化最劇烈的。SOCS1是一個誘導性表達的基因，表達倍數(shù)有明顯增加。我們提出假設:這些分子之間會不會通過miR-155形成一個調(diào)控網(wǎng)絡在內(nèi)毒素耐受中發(fā)揮作用？我們通過一系列實驗，揭示了巨噬細胞中TLR4信號通路中接頭蛋白TAB2與TLR4通路的負向調(diào)節(jié)分子SOCS1，競爭結合miRNA-155，TAB2 mRNA可能以ceRNA的方式上調(diào)SOCS1的蛋白表達，從而在巨噬細胞內(nèi)毒素耐受過程中發(fā)揮精細調(diào)節(jié)作用。
　　首先，構建了

4、TAB23'UTR穩(wěn)定過表達的小鼠巨噬RAW264.7細胞系，誘導內(nèi)毒素耐受的模型，與對照細胞相比，可以檢測到此細胞系中SOCS1蛋白的表達明顯上調(diào)，而分泌的細胞因子IL-6和TNF-α水平相應的下降。用siRNA敲減RAW264.7中TAB2 mRNA的表達，檢測到SOCS1蛋白表達顯著下降，同時細胞上清中的IL-6和TNF-α的含量相應地升高。為了說明TAB2 mRNA調(diào)控SOCS1蛋白是依賴于miR-155，同時干擾miR-155

5、和TAB2 mRNA的表達，在上述內(nèi)毒素耐受的細胞模型中則SOCS1的蛋白水平則無明顯變化。這說明，TAB2 mRNA除了作為信使RNA翻譯目的蛋白質(zhì)外，還可能在microRNA的調(diào)控網(wǎng)絡中發(fā)揮作用，通過microRNA去間接調(diào)控其他基因的蛋白水平。
　　上述實驗結果提示，在內(nèi)毒素耐受的巨噬細胞中，TAB2 mRNA通過競爭結合miRNA-155，導致結合到SOCS1mRNA上的miR-155減少，從而上調(diào)SOCS1蛋白的表達，從

6、而在內(nèi)毒素耐受中的調(diào)控中發(fā)揮作用。上述研究初步揭示了ceRNA可能是參與內(nèi)毒素耐受調(diào)控的一種新的方式，為深入研究內(nèi)毒素耐受的機制提供了新的認識，也可能為感染性疾病的診斷和治療提供新的思路。
　　第二部分 白細胞介素27抑制肥大細胞介導的免疫應答及其機制研究
　　白細胞介素27（Interleukin27，IL-27）最初是作為可以促進Th1型應答而被認知的一種細胞因子，而隨后的研究證明IL-27具有重要的抑制炎癥的功能。肥大

7、細胞是介導過敏反應的主要效應細胞，也是lgE相關疾病主要的效應細胞。我們前期實驗發(fā)現(xiàn)，IL-27處理后肥大細胞表面IL-27受體亞基WSX-1和gp130的表達上調(diào)，WSX-1缺陷的小鼠來源的肥大細胞對IgE觸發(fā)的應答增強，提示IL-27可能對肥大細胞的功能具有調(diào)控作用。本研究的目的是研究IL-27對肥大細胞介導的免疫應答的抑制效應及其相關機制。
　　我們利用WSX-1缺陷和野生型的小鼠，建立了肥大細胞活化為主的三個疾病模型:被動

8、性全身超敏反應、被動皮膚過敏反應和慢性氣道炎癥模型。結果顯示:與野生型(WT)小鼠比較，IL-27受體亞基WSX-1缺陷的小鼠（WSX-1-/-）的小鼠表現(xiàn)出更嚴重的全身性過敏反應和局部皮膚過敏反應，相應的血中組胺產(chǎn)生水平也升高。慢性氣道炎癥模型顯示:WSX-1-/-的小鼠肺臟中有更嚴重的炎性細胞的浸潤，以噬酸性細胞和杯狀細胞浸潤為主，WSX-1-/-的小鼠有更多的Th2型、炎性相關細胞因子包括IL-4，IL-5，IL-13等的分泌。在

9、體外用重組IL-27處理WT和WSX-1-/-小鼠骨髓來源的肥大細胞，WSX-1-/-來源的肥大細胞分泌更多的Th2型和炎性相關的細胞因子，并且脫顆粒程度較之野生型小鼠來源的肥大細胞有明顯增加。與野生型(WT)小鼠相比，WSX-1-/-小鼠骨髓來源的活化的肥大細胞，其主要信號途徑Grb2/PLC-γ1/SLP-76和旁路信號通路PI3K/Akt/IκBα，以及下游的MAPK和鈣離子流有明顯的增強，而且連接FcεRI受體和下游信號的關鍵分