神經(jīng)前體細(xì)胞體外誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元和移植治療帕金森病實驗研究.pdf

1、該研究目的將大鼠胚胎中腦神經(jīng)前體細(xì)胞在體外進(jìn)行多巴胺能神經(jīng)元的誘導(dǎo),移植到腦內(nèi)后可以分化為多巴胺能神經(jīng)元分泌多巴胺神經(jīng)遞質(zhì),以達(dá)到治療PD的目的.首先分離培養(yǎng)E14.5 SD大鼠胚胎中腦腹側(cè)神經(jīng)前體細(xì)胞,并進(jìn)行傳代;在體外對神經(jīng)前體細(xì)胞行多巴胺能的誘導(dǎo),使其有較高的比例具有向多巴胺能分化的潛能,然后在它們分化之前,移植到大鼠PD模型的紋狀體內(nèi),觀察經(jīng)過這樣處理的神經(jīng)前體細(xì)胞,能否在體內(nèi)存活,并分化為所需要的多巴胺能神經(jīng)元.現(xiàn)摘要如下:第

2、一部分;研究目的:對來源于E14.5 SD大鼠胚胎中腦腹側(cè)的組織細(xì)胞,經(jīng)過一系列分離操作后種植,探討能否在體外長時間的培養(yǎng)并傳代,傳代后的細(xì)胞在同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)是否仍保持母細(xì)胞的形態(tài)及其它細(xì)胞特點;對這些細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞特性的鑒定,是否具有后者的所有特性.方法:辨別并分離E14.5 SD大鼠胚胎中腦腹側(cè)組織細(xì)胞,以×10<'6>/ml密度種植,在沒有血清的限定培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng),并含有bFGF.神經(jīng)球增大到150μm左右后輕輕吹散,使之成

3、為單細(xì)胞懸液,并給予傳代.對經(jīng)過傳代的細(xì)胞,進(jìn)行nestin的免疫組化檢測,同時進(jìn)行BrdU增殖實驗;在所培養(yǎng)的細(xì)胞分化前和分化后,都進(jìn)行NSE和GFAP免疫組化染色,它們分別是神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志.結(jié)論:來源于E14.5大鼠胚胎中腦腹側(cè)的神經(jīng)前體細(xì)胞,可以在體外無血清培養(yǎng)基內(nèi)長時間生長、分裂和傳代,傳代后的細(xì)胞仍保持神經(jīng)干細(xì)胞的特性.bFGF對神經(jīng)前體細(xì)胞得分裂起關(guān)鍵作用.經(jīng)過鑒定,所培養(yǎng)的細(xì)胞符合神經(jīng)干細(xì)胞的定義,即

4、未分化、能夠自我更新和復(fù)制、具有多能性.第二部分;研究目的:來源于E14.5 SD大鼠胚胎中腦腹側(cè)的神經(jīng)前體細(xì)胞,在體外培養(yǎng)并傳代后,與一系列造血系統(tǒng)細(xì)胞因子和其它誘導(dǎo)條件共同孵育,觀察其能否提高分化多巴胺神經(jīng)元的比例;以及經(jīng)過這樣誘導(dǎo)的神經(jīng)前體細(xì)胞,其子代細(xì)胞的形態(tài)發(fā)育與不同誘導(dǎo)條件有什么關(guān)系.方法:制備紋狀體條件培養(yǎng)基和中腦膜裂解碎片;對經(jīng)過傳代的大鼠胚胎中腦神經(jīng)前體細(xì)胞,與造血系統(tǒng)細(xì)胞因子和自己制備紋狀體條件培養(yǎng)基、中腦膜裂解碎片

5、共同孵育,細(xì)胞因子包括IL-1μ、GDNF、LIF.這5種誘導(dǎo)條件按不同組合分別與神經(jīng)前體細(xì)胞孵育,然后在后者分化后行TH免疫組化染色,觀察陽性細(xì)胞的數(shù)目及形態(tài).經(jīng)過所有誘導(dǎo)條件聯(lián)合孵育的神經(jīng)前體細(xì)胞,分化后行Western Blot實驗.結(jié)論:來源于E14.5大鼠胚胎中腦腹側(cè)的神經(jīng)前體細(xì)胞,可以在體外無血清培養(yǎng)基內(nèi)長時間生長、分裂和傳代,傳代后的細(xì)胞仍保持神經(jīng)干細(xì)胞的特性.bFGF對神經(jīng)前體細(xì)胞得分裂直關(guān)鍵作用.經(jīng)過鑒定,所培養(yǎng)的細(xì)胞

6、符合神經(jīng)干細(xì)胞的定義,即未分化、能夠自我更新和復(fù)制、具有多能性.第三部分;研究目的:經(jīng)過多巴胺能誘導(dǎo)的大鼠胚胎中腦神經(jīng)前體細(xì)胞,在沒有分化為終末神經(jīng)元之前,移植到SD大鼠PD模型腦紋體的殼核.檢測經(jīng)過上述處理的神經(jīng)前體細(xì)胞能否在宿主腦內(nèi)存活,并分化為多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞.方法:應(yīng)用6-OHDA對出生4~5月的SD大鼠行SNc和VTA兩點注射,制作PD的動物模型.在移植之前,注射美藍(lán)作預(yù)實驗以確認(rèn)移植部位的精確性.經(jīng)過IL-1α、GDNF、

7、LIF、紋狀體條件培養(yǎng)基和中腦膜裂解碎片聯(lián)合孵育的神經(jīng)前體細(xì)胞,一部分作BrdU的標(biāo)記,另一部分不做標(biāo)記,分別移植到PD動物模型的紋狀體殼核.在移植后1、2和4周處死動物作腦切片,移植BrdU標(biāo)記細(xì)胞的作BrdU免疫組化染色,誘導(dǎo)后直接移植的作TH免疫組化染色.結(jié)論:應(yīng)用6-OHDA對大鼠SNc和VTA兩點注射的方法,能夠成功模仿人類PD癥狀的動物模型,因而在這樣的模型進(jìn)行的動物實驗是有意義的.預(yù)實驗證實應(yīng)用這種移植方面可以保證移植位置