神經(jīng)干細胞體外培養(yǎng)、分化及移植治療大鼠帕金森病的實驗研究.pdf

1、研究背景 帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是中老年人常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，65歲以上的老人發(fā)病率達l％，其基本病理改變是黑質(zhì)(SN)的多巴胺能神經(jīng)元發(fā)生退行性病變，使接受黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元投射的紋狀體多巴胺含量明顯下降；或紋狀體受體的退行性變，導致錐體外系功能失調(diào)，從而出現(xiàn)震顫、僵直、運動障礙等臨床癥狀。臨床和實驗研究顯示這種神經(jīng)退行性病變是多因素造成的，包括遺傳、感染、外傷、藥物等。目前其

2、治療方法仍以多巴胺替代類藥物為主，雖然在多數(shù)病例初期試用有效，但并不能減緩黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元退行性變的進程，隨著使用時間的延長療效將逐漸下降，且不良反應增強。因此人們開始嘗試通過神經(jīng)組織移植替代變性的多巴胺能神經(jīng)元。 神經(jīng)干細胞的增殖及分化能力使利用神經(jīng)干細胞替代多種損傷和退行性變的組織細胞的治療成為可能。成人腦內(nèi)存在神經(jīng)干細胞且具有較大的可塑性，但在神經(jīng)元損傷應答時，腦內(nèi)神經(jīng)干細胞產(chǎn)生新的神經(jīng)元的能力有限。在帕金森病患者腦內(nèi)有

3、較大量神經(jīng)元死亡時，僅靠自身神經(jīng)干細胞沒有足夠能力完成自我修復，因此通過植入新的神經(jīng)干細胞來代替因退行性改變而喪失的多巴胺能神經(jīng)元在理論上是可行的，且有以下有利條件：帕金森病的發(fā)病機理比較清楚，治療的目標明確——恢復紋狀體多巴胺遞質(zhì)水平；帕金森病相關的神經(jīng)核團——黑質(zhì)及紋狀體的解剖定位明確；已建立了嚙齒類及靈長類動物的帕金森病模型，可較好模擬人類帕金森病癥狀及評價其治療效果；胎兒腦組織移植治療帕金森病已有相當?shù)呐R床經(jīng)驗，為神經(jīng)干細胞移植

4、治療帕金森病建立了基礎。 研究目的 1．探討如何在體外建立神經(jīng)干細胞快速增殖及定向誘導分化為多巴胺能神經(jīng)元 的穩(wěn)定高效的技術(shù)平臺，從而為神經(jīng)干細胞移植治療帕金森病提供充足有效的細胞來源。 2．探討體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞及定向誘導分化的多巴胺能神經(jīng)元移植治療帕金森病大鼠的療效及其在行為學、免疫組織化學、生化學等方面的比較研究。 方法和結(jié)果 第一部分大鼠神經(jīng)干細胞體外增殖培養(yǎng)及定向

5、誘導分化成 多巴胺能神經(jīng)元的實驗研究 方法 1．大鼠神經(jīng)干細胞的體外培養(yǎng)和誘導分化 a.神經(jīng)干細胞的分離與原代培養(yǎng)：分離孕14-15d的胚胎大鼠中腦腹側(cè)腦組織，經(jīng)胰蛋白酶消化后，在含B27(20mg／ml)、EGF(20ng／ml)、bFGF(20ng／ml)、100U／ml青霉素和100U／ml鏈霉素的DMEM／F12(1:1)無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)。每3～4d半量換液一次，7～10d后傳代。 b

6、.神經(jīng)干細胞的傳代培養(yǎng)：將原代培養(yǎng)7～10d的神經(jīng)細胞球機械吹散，制成新的細胞懸液，在無血清培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔6-7d機械分離傳代一次。 c.神經(jīng)干細胞誘導向多巴胺能神經(jīng)元分化：將傳代的神經(jīng)干細胞在含45％DMEM、45％F12、10％胎牛血清、IL-1 a(100pg／ml)、IL-ll(lng／mg)、LIF(lng／mg)、GDNF(10ng/ml)的誘導分化液中，定向誘導向多巴胺能神經(jīng)元分化。 2．高效液相色

7、譜分析法(HPLC)檢測分化細胞的培養(yǎng)上清中DA含量 a．吸出分化細胞培養(yǎng)上清，加入高氯酸溶液使其終濃度為0.1mol／L，離心后進行高效液相色譜檢測。 b．棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入56mmol／L KCL溶液，置于CO<,2>培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 min，刺激細胞分泌DA。 c．吸出細胞培養(yǎng)液，加入高氯酸溶液使其終濃度為0.1mol／L，離心后進行高效液相色譜檢測。 3．神經(jīng)干細胞及分化細胞的免疫細胞化學

8、鑒定 結(jié)果 1．大鼠神經(jīng)干細胞體外培養(yǎng)和誘導分化的形態(tài)學特征 2．高效液相色譜分析法檢測定向誘導分化細胞的培養(yǎng)上清中：IIA含量應用DA釋放刺激劑刺激分化細胞15min后，高效液相色譜分析法檢測分化細胞培養(yǎng)上清中有26.433ng／ml的多巴胺產(chǎn)生。 3．神經(jīng)干細胞及分化細胞的免疫細胞化學鑒定 第二部分 神經(jīng)干細胞移植治療帕金森病大鼠的療效研究 材料 健康的成年雄性SD大鼠90只，體

9、重220～260g 6-羥基多巴胺(Hydroxydopamine，6-OHDA)，阿樸嗎啡(Apomorphine)，溴脫氧核苷尿嘧啶(Bromodeoxyuridine，BrdU)，BrdU抗體，TH抗體，MAP2抗體，GFAP抗體流式細胞儀(BECKMAN—COULTER)，高效液相色譜分析儀(WATERS510高壓泵、HP1049A電化學檢測器)，BDS C18色譜柱，ESCO凈化工作臺，自動高壓滅菌器(HRAYAMA)，

10、Galaxy R CO<,2>培養(yǎng)箱，Hamilton微量注射器，冰凍切片機，倒置相差顯微鏡 方法 1．移植前的準備 a．神經(jīng)干細胞的體外培養(yǎng)和誘導向多巴胺能神經(jīng)元分化。 b．6-OHDA帕金森病大鼠模型的制備。 c.帕金森病大鼠模型的篩選。 神經(jīng)干細胞體外培養(yǎng)、分化及移植治療大鼠帕金森病的實驗研究 d．隨機取5只帕金森病大鼠高效液相色譜分析法檢測損傷側(cè)紋狀體DA、DOPAC 含量

11、。 2．動物分組 將36只帕金森病大鼠隨機分成3組分別接受立體定向移植： 神經(jīng)干細胞組(A組)：12只，腦立體定向手術(shù)向大鼠紋狀體注射6×lO<'5>個神經(jīng)干細胞懸液。再隨機分為2個小組：移植后行免疫組織化學檢測組(A1)：6只。移植后行腦勻漿檢測DA、DOPAC含量組(A2)：6只。 分化細胞組(B組)：12只，腦立體定向手術(shù)向大鼠紋狀體注射6×10<'5>個分化細胞懸液。再隨機分為2個小組： 移

12、植后行免疫組織化學檢測組(B1)：6只。 移植后行腦勻漿檢測DA、DOPAC含量組(B2)：6只。 手術(shù)對照組(C組)：12只，腦立體定向手術(shù)向大鼠紋狀體注射等體積的DMEM／F12細胞培養(yǎng)液。再隨機分為2個小組： 移植后行免疫組織化學檢測組(C1)：6只。 移植后行腦勻漿檢測DA、DOPAC含量組(C2)：6只。 3．立體定向移植 5．利用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析，P<

13、0.05差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果 1．帕金森病大鼠模型的建立 90只健康成年SD雄性大鼠接受6-羥基多巴胺注射，經(jīng)篩選確定成功帕金森病大鼠模型43只，成功率為47.8％。 2．分化細胞流式細胞儀檢測 分化細胞經(jīng)流式細胞儀檢測，其中TH陽性細胞百分率為16.7％，MAP2陽性細胞百分率32.8％，GFAP陽性細胞百分率59.0％。 3．帕金森病大鼠移植前后行為學變化

14、 分化細胞組在移植后第4周旋轉(zhuǎn)圈數(shù)與術(shù)前比較有顯著性下降，隨后旋轉(zhuǎn)圈數(shù)逐漸減少并于術(shù)后7周開始穩(wěn)定，術(shù)后第10周旋轉(zhuǎn)圈數(shù)較術(shù)前減少60.2％。神經(jīng)干細胞組與手術(shù)對照組移植后旋轉(zhuǎn)圈數(shù)與術(shù)前比較無顯著性差異。 4．帕金森病大鼠移植前后紋狀體內(nèi)DA、DOPAC含量的變化 移植術(shù)后10周分化細胞組大鼠紋狀體內(nèi)DA、DOPAC的含量較移植前明顯升高，統(tǒng)計學分析有顯著性差異，但與健康SD大鼠正常紋狀體內(nèi)DA、DOPAC

15、的含量相比，仍未達到正常水平；神經(jīng)干細胞組與手術(shù)對照組大鼠紋狀體內(nèi)DA、DOPAC的含量較移植前有所下降，但統(tǒng)計學分析沒有顯著性差異。 5．帕金森病大鼠移植后腦切片免疫組織化學檢測 神經(jīng)干細胞移植組大鼠紋狀體可以見到BrdU陽性細胞，細胞分布于移植區(qū)，并沿針道向周圍腦實質(zhì)遷移，手術(shù)對照組大鼠紋狀體未見BrdU陽性細胞。神經(jīng)干細胞組及手術(shù)對照組大鼠紋狀體內(nèi)未見TH陽性細胞，而分化細胞移植組大鼠紋狀體內(nèi)可以見到TH陽

16、性細胞，大部分細胞位于移植區(qū)周圍，較少向腦實質(zhì)內(nèi)遷移。 結(jié)論 1．神經(jīng)干細胞在體外無血清培養(yǎng)液中可以快速穩(wěn)定地增殖并能耐受較長時間的 低溫冷凍保存。 2．神經(jīng)干細胞在誘導分化液中可以定向誘導分化成數(shù)量可觀的TH陽性神經(jīng)元，該神經(jīng)元具有分泌多巴胺的功能。 3．體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞移植帕金森病大鼠紋狀體可以存活，但未能明顯改善大鼠的行為學癥狀，移植的紋狀體內(nèi)DA及DOPAC含量未見提高，腦組織切片免疫組化染色