神經干細胞體外培養(yǎng)、分化及移植治療大鼠帕金森病的實驗研究.pdf

1、研究背景 帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是中老年人常見的中樞神經系統變性疾病，65歲以上的老人發(fā)病率達l％，其基本病理改變是黑質(SN)的多巴胺能神經元發(fā)生退行性病變，使接受黑質多巴胺能神經元投射的紋狀體多巴胺含量明顯下降；或紋狀體受體的退行性變，導致錐體外系功能失調，從而出現震顫、僵直、運動障礙等臨床癥狀。臨床和實驗研究顯示這種神經退行性病變是多因素造成的，包括遺傳、感染、外傷、藥物等。目前其

2、治療方法仍以多巴胺替代類藥物為主，雖然在多數病例初期試用有效，但并不能減緩黑質區(qū)神經元退行性變的進程，隨著使用時間的延長療效將逐漸下降，且不良反應增強。因此人們開始嘗試通過神經組織移植替代變性的多巴胺能神經元。 神經干細胞的增殖及分化能力使利用神經干細胞替代多種損傷和退行性變的組織細胞的治療成為可能。成人腦內存在神經干細胞且具有較大的可塑性，但在神經元損傷應答時，腦內神經干細胞產生新的神經元的能力有限。在帕金森病患者腦內有

3、較大量神經元死亡時，僅靠自身神經干細胞沒有足夠能力完成自我修復，因此通過植入新的神經干細胞來代替因退行性改變而喪失的多巴胺能神經元在理論上是可行的，且有以下有利條件：帕金森病的發(fā)病機理比較清楚，治療的目標明確——恢復紋狀體多巴胺遞質水平；帕金森病相關的神經核團——黑質及紋狀體的解剖定位明確；已建立了嚙齒類及靈長類動物的帕金森病模型，可較好模擬人類帕金森病癥狀及評價其治療效果；胎兒腦組織移植治療帕金森病已有相當的臨床經驗，為神經干細胞移植

4、治療帕金森病建立了基礎。 研究目的 1．探討如何在體外建立神經干細胞快速增殖及定向誘導分化為多巴胺能神經元 的穩(wěn)定高效的技術平臺，從而為神經干細胞移植治療帕金森病提供充足有效的細胞來源。 2．探討體外培養(yǎng)的神經干細胞及定向誘導分化的多巴胺能神經元移植治療帕金森病大鼠的療效及其在行為學、免疫組織化學、生化學等方面的比較研究。 方法和結果 第一部分大鼠神經干細胞體外增殖培養(yǎng)及定向

5、誘導分化成 多巴胺能神經元的實驗研究 方法 1．大鼠神經干細胞的體外培養(yǎng)和誘導分化 a.神經干細胞的分離與原代培養(yǎng)：分離孕14-15d的胚胎大鼠中腦腹側腦組織，經胰蛋白酶消化后，在含B27(20mg／ml)、EGF(20ng／ml)、bFGF(20ng／ml)、100U／ml青霉素和100U／ml鏈霉素的DMEM／F12(1:1)無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)。每3～4d半量換液一次，7～10d后傳代。 b

6、.神經干細胞的傳代培養(yǎng)：將原代培養(yǎng)7～10d的神經細胞球機械吹散，制成新的細胞懸液，在無血清培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔6-7d機械分離傳代一次。 c.神經干細胞誘導向多巴胺能神經元分化：將傳代的神經干細胞在含45％DMEM、45％F12、10％胎牛血清、IL-1 a(100pg／ml)、IL-ll(lng／mg)、LIF(lng／mg)、GDNF(10ng/ml)的誘導分化液中，定向誘導向多巴胺能神經元分化。 2．高效液相色

7、譜分析法(HPLC)檢測分化細胞的培養(yǎng)上清中DA含量 a．吸出分化細胞培養(yǎng)上清，加入高氯酸溶液使其終濃度為0.1mol／L，離心后進行高效液相色譜檢測。 b．棄去培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入56mmol／L KCL溶液，置于CO<,2>培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 min，刺激細胞分泌DA。 c．吸出細胞培養(yǎng)液，加入高氯酸溶液使其終濃度為0.1mol／L，離心后進行高效液相色譜檢測。 3．神經干細胞及分化細胞的免疫細胞化學

8、鑒定 結果 1．大鼠神經干細胞體外培養(yǎng)和誘導分化的形態(tài)學特征 2．高效液相色譜分析法檢測定向誘導分化細胞的培養(yǎng)上清中：IIA含量應用DA釋放刺激劑刺激分化細胞15min后，高效液相色譜分析法檢測分化細胞培養(yǎng)上清中有26.433ng／ml的多巴胺產生。 3．神經干細胞及分化細胞的免疫細胞化學鑒定 第二部分 神經干細胞移植治療帕金森病大鼠的療效研究 材料 健康的成年雄性SD大鼠90只，體

9、重220～260g 6-羥基多巴胺(Hydroxydopamine，6-OHDA)，阿樸嗎啡(Apomorphine)，溴脫氧核苷尿嘧啶(Bromodeoxyuridine，BrdU)，BrdU抗體，TH抗體，MAP2抗體，GFAP抗體流式細胞儀(BECKMAN—COULTER)，高效液相色譜分析儀(WATERS510高壓泵、HP1049A電化學檢測器)，BDS C18色譜柱，ESCO凈化工作臺，自動高壓滅菌器(HRAYAMA)，

10、Galaxy R CO<,2>培養(yǎng)箱，Hamilton微量注射器，冰凍切片機，倒置相差顯微鏡 方法 1．移植前的準備 a．神經干細胞的體外培養(yǎng)和誘導向多巴胺能神經元分化。 b．6-OHDA帕金森病大鼠模型的制備。 c.帕金森病大鼠模型的篩選。 神經干細胞體外培養(yǎng)、分化及移植治療大鼠帕金森病的實驗研究 d．隨機取5只帕金森病大鼠高效液相色譜分析法檢測損傷側紋狀體DA、DOPAC 含量

11、。 2．動物分組 將36只帕金森病大鼠隨機分成3組分別接受立體定向移植： 神經干細胞組(A組)：12只，腦立體定向手術向大鼠紋狀體注射6×lO<'5>個神經干細胞懸液。再隨機分為2個小組：移植后行免疫組織化學檢測組(A1)：6只。移植后行腦勻漿檢測DA、DOPAC含量組(A2)：6只。 分化細胞組(B組)：12只，腦立體定向手術向大鼠紋狀體注射6×10<'5>個分化細胞懸液。再隨機分為2個小組： 移

12、植后行免疫組織化學檢測組(B1)：6只。 移植后行腦勻漿檢測DA、DOPAC含量組(B2)：6只。 手術對照組(C組)：12只，腦立體定向手術向大鼠紋狀體注射等體積的DMEM／F12細胞培養(yǎng)液。再隨機分為2個小組： 移植后行免疫組織化學檢測組(C1)：6只。 移植后行腦勻漿檢測DA、DOPAC含量組(C2)：6只。 3．立體定向移植 5．利用SPSS10.0統計軟件進行數據處理和分析，P<

13、0.05差異有統計學意義。 結果 1．帕金森病大鼠模型的建立 90只健康成年SD雄性大鼠接受6-羥基多巴胺注射，經篩選確定成功帕金森病大鼠模型43只，成功率為47.8％。 2．分化細胞流式細胞儀檢測 分化細胞經流式細胞儀檢測，其中TH陽性細胞百分率為16.7％，MAP2陽性細胞百分率32.8％，GFAP陽性細胞百分率59.0％。 3．帕金森病大鼠移植前后行為學變化

14、 分化細胞組在移植后第4周旋轉圈數與術前比較有顯著性下降，隨后旋轉圈數逐漸減少并于術后7周開始穩(wěn)定，術后第10周旋轉圈數較術前減少60.2％。神經干細胞組與手術對照組移植后旋轉圈數與術前比較無顯著性差異。 4．帕金森病大鼠移植前后紋狀體內DA、DOPAC含量的變化 移植術后10周分化細胞組大鼠紋狀體內DA、DOPAC的含量較移植前明顯升高，統計學分析有顯著性差異，但與健康SD大鼠正常紋狀體內DA、DOPAC

15、的含量相比，仍未達到正常水平；神經干細胞組與手術對照組大鼠紋狀體內DA、DOPAC的含量較移植前有所下降，但統計學分析沒有顯著性差異。 5．帕金森病大鼠移植后腦切片免疫組織化學檢測 神經干細胞移植組大鼠紋狀體可以見到BrdU陽性細胞，細胞分布于移植區(qū)，并沿針道向周圍腦實質遷移，手術對照組大鼠紋狀體未見BrdU陽性細胞。神經干細胞組及手術對照組大鼠紋狀體內未見TH陽性細胞，而分化細胞移植組大鼠紋狀體內可以見到TH陽

16、性細胞，大部分細胞位于移植區(qū)周圍，較少向腦實質內遷移。 結論 1．神經干細胞在體外無血清培養(yǎng)液中可以快速穩(wěn)定地增殖并能耐受較長時間的 低溫冷凍保存。 2．神經干細胞在誘導分化液中可以定向誘導分化成數量可觀的TH陽性神經元，該神經元具有分泌多巴胺的功能。 3．體外培養(yǎng)的神經干細胞移植帕金森病大鼠紋狀體可以存活，但未能明顯改善大鼠的行為學癥狀，移植的紋狀體內DA及DOPAC含量未見提高，腦組織切片免疫組化染色