神經(jīng)干細胞體外定向分化為多巴胺能神經(jīng)元的實驗研究.pdf

1、目的：在探討神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)分離培養(yǎng)和擴增的基礎上，重點研究抗壞血酸(ascorbic acid，AA)和膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)對體外培養(yǎng)的NSCs定向分化為多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元的影響，為DA能神經(jīng)元的定向分化研究提供基礎的實驗依據(jù)。 方法：(1)從新生24h內(nèi)的SD

2、大鼠腦組織分離NSCs，采用無血清懸浮培養(yǎng)法進行NSCs體外擴增培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，通過繪制細胞生長曲線觀察NSCs的自我更新和增殖能力，采用免疫細胞化學法檢測NSCs標志物神經(jīng)上皮干細胞蛋白(neuroepithelial stem cell protein，Nestin)的表達及分化后細胞神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron special enolase，NSE)、膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary a

3、cidic protein，GFAP)和2，3-環(huán)核甘酸磷酸二脂酶(cyclic nucleotide phosphohydrolase，CNP)的表達；(2)第二代NSCs誘導培養(yǎng)基中分別給予不同濃度的AA，10ng/mlGDNF及100 μmol/1 AA+10ng/ml GDNF。10d后終止誘導，進行DA能神經(jīng)元特異性標記物酪氨酸羥化酶(tyros ine hydroxylase，TH)和多巴胺轉運蛋白(dopamine tra

4、nsporter，DAT)的免疫細胞化學檢測和TH基因的RT-PCR檢測。 結果：(1)從新生SD大鼠腦組織分離的細胞在無血清的培養(yǎng)基中形成懸浮的神經(jīng)球。神經(jīng)球具有自我更新和表達Nestin的能力，分化后的細胞能表達神經(jīng)元、星型膠質細胞及少突膠質細胞的特異性抗原。(2)與對照組比較，不同濃度的AA組、10ng/ml GDNF組及100 μmol/1 AA+10ng/ml GDNF聯(lián)合誘導組均能增加NSCs向TH陽性細胞分化的比率

5、(p<0.05)。與單獨運用100 μmol/1 AA或10ng/ml GDNF組比較，100 μmol/1AA+10ng/ml GDNF聯(lián)合誘導組可明顯提高NSCs向TH陽性細胞分化的比率(p<0.05)。各誘導組均檢測到TH mRNA的表達。 結論：(1)從新生大鼠的腦組織中成功分離出NSCs，其具有在體外自我更新和增殖、多向分化潛能及表達Nestin的能力。(2)在本實驗中，不同濃度AA組均能促進NSCs向DA能神經(jīng)元分化