西尼羅病毒套式RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法的建立.pdf

1、西尼羅病毒（WNV）是一種蟲(chóng)媒病毒，屬于黃病毒科，黃病毒屬。在自然界中，西尼羅病毒在鳥(niǎo)和蚊子（主要是庫(kù)蚊）之間形成循環(huán)鏈，主要感染人和馬。西尼羅病毒主要分布在非洲、中東、亞洲中西部、印度和歐洲。1999年8月西尼羅病毒首次在西半球登陸，美國(guó)紐約發(fā)生人和馬感染西尼羅腦炎，此后西尼羅病毒迅速傳遍整個(gè)美國(guó)，并有向外傳播的趨勢(shì)。目前，沒(méi)有有效的治療措施，因此，建立有效的檢測(cè)方法來(lái)預(yù)防西尼羅病毒侵入是非常重要的。
　　 1.西尼羅病毒套式

2、RT-PCR檢測(cè)方法的建立
　　 從GenBank上調(diào)取西尼羅病毒的基因序列，經(jīng)過(guò)分析，設(shè)計(jì)并合成兩套套式RT-PCR引物，分別對(duì)西尼羅病毒滅活苗進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果能擴(kuò)增出與目的片斷大小一致的條帶，建立了套式RT-PCR檢測(cè)方法，經(jīng)反應(yīng)條件優(yōu)化后，對(duì)乙型腦炎病毒（JEV）、黃熱病毒（YFV）等11種相關(guān)病毒核酸進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)具有良好的特異性；能分別擴(kuò)增出85個(gè)拷貝和62個(gè)拷貝的雙鏈DNA，顯示建立的套式RT-PCR檢測(cè)方法具有高效、

3、快速、特異、靈敏的特點(diǎn)，可用于口岸WNV的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)。
　　 2.西尼羅病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PcR檢測(cè)方法的建立
　　 從GenBank上調(diào)取西尼羅病毒的基因序列，針對(duì)其基因保守區(qū)域的核苷酸序列，用DNAStar和Primer Expression3.0軟件設(shè)計(jì)3對(duì)引物和TaqMan探針，以西尼羅病毒的cDNA為模板，建立了WNYA、WNYB和WNYC三套實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法，經(jīng)反應(yīng)條件優(yōu)化后，對(duì)JEV、YFV等1

4、1種病毒核酸進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)具有良好的特異性；對(duì)10倍倍比稀釋的雙鏈DNA、質(zhì)粒DNA、cDNA和RNA進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)其靈敏度，發(fā)現(xiàn)建立的WNYA和WNYC熒光能分別擴(kuò)增出30個(gè)拷貝和65個(gè)拷貝的雙鏈DNA以及420個(gè)拷貝和460個(gè)拷貝的質(zhì)粒DNA，WNYB對(duì)cDNA的擴(kuò)增效率明顯低于WNYA和WNYC，證明建立的WNYA和WNYC實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法具有高效、快速、特異、靈敏的特點(diǎn)，可用于WNV樣品的檢測(cè)。
　　 3.西尼

5、羅病毒基因片斷的克隆
　　 本研究以常規(guī)RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增套式和熒光PCR檢測(cè)方法所需的目的片斷，將其插入到pMD18-T Vector中進(jìn)行克隆，獲得的陽(yáng)性克隆分別為pMD18-T-A、pMD18-T-B、pMD18-T-YA和pMD18-T-YC。測(cè)序結(jié)果與GenBank已發(fā)表的序列進(jìn)行比較證實(shí)為WNV序列，表明建立的PCR方法是特異性的，獲得的克隆質(zhì)?？勺鳛榻⒌腜CR方法的陽(yáng)性對(duì)照。
　　 4.西尼羅病毒檢測(cè)試