熒光定量RT-PCR檢測CCHFV方法的建立及假病毒陽性對照的制備.pdf

1、目的：
　　克里米亞-剛果出血熱（Crimea Congo hemorrhagic fever, CCHF）是一種由克里米亞-剛果出血熱病毒(Crimea Congo hemorrhagic fever virus, CCHFV）引起的烈性傳染病，致死率可達40％。CCHF是一種蜱媒自然疫源性人畜共患病毒傳染病。CCHF是對人類危害最嚴重的疾病之一，對人的健康和社會安全有很大的威脅。到目前為止，CCHF還沒有針對性的治療藥物和安全

2、有效的疫苗。因此本研究目的是建立一種快速、準確、敏感的CCHFV的檢測方法，制備該方法的假病毒陽性對照。這將對疾病的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，降低疾病爆發(fā)的風險、降低病死率非常重要。
　　方法：
　　根據(jù)Genbank中公布的CCHFV保守性強的S片段，設計引物和探針。通過優(yōu)化反應體系和反應程序，建立了CCHFV的一步法熒光定量RT-PCR檢測方法。提取CCHFV毒株RNA驗證該方法的靈敏度、重復性。對登革病毒核酸、基孔肯雅熱

3、病毒核酸、黃熱病毒核酸、漢坦病毒核酸、乙型腦炎病毒核酸、流感病毒核酸（H1N1和H3N2）進行擴增反應檢測方法特異性。合成CCHFV目的基因質粒DNA、構建plv-CCHF重組慢病毒載體。對陽性對照假病毒顆粒進行包裝，共轉染293T細胞。48小時后收集上清，用實時熒光RT-PCR方法檢測假病毒包裝情況。將構建的假病毒加入核酸保護劑制備CCHFV陽性對照質控品并進行穩(wěn)定性試驗。應用該方法檢測白云機場出入境的100例發(fā)熱患者血清。
　

4、　結果：
　　CCHFV的一步法熒光定量RT-PCR方法的靈敏度為7.26×102 copies/μl。方法特異性強，登革病毒核酸、基孔肯雅病毒核酸、黃熱病毒核酸、漢坦病毒核酸、乙型腦炎病毒核酸、流感病毒核酸（H1N1和 H3N2）均無特異性擴增曲線。方法的重復性好，7.26×109copies/μl、7.26×107copies/μl CCHFV RNA模板重復測定五次無顯著差異。制備了可對CCHFV實時熒光RT-PCR全程監(jiān)測