熒光定量RT-PCR檢測CCHFV方法的建立及假病毒陽性對照的制備.pdf

1、目的：
　　克里米亞-剛果出血熱（Crimea Congo hemorrhagic fever, CCHF）是一種由克里米亞-剛果出血熱病毒(Crimea Congo hemorrhagic fever virus, CCHFV）引起的烈性傳染病，致死率可達(dá)40％。CCHF是一種蜱媒自然疫源性人畜共患病毒傳染病。CCHF是對人類危害最嚴(yán)重的疾病之一，對人的健康和社會安全有很大的威脅。到目前為止，CCHF還沒有針對性的治療藥物和安全

2、有效的疫苗。因此本研究目的是建立一種快速、準(zhǔn)確、敏感的CCHFV的檢測方法，制備該方法的假病毒陽性對照。這將對疾病的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，降低疾病爆發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)、降低病死率非常重要。
　　方法：
　　根據(jù)Genbank中公布的CCHFV保守性強(qiáng)的S片段，設(shè)計(jì)引物和探針。通過優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，建立了CCHFV的一步法熒光定量RT-PCR檢測方法。提取CCHFV毒株RNA驗(yàn)證該方法的靈敏度、重復(fù)性。對登革病毒核酸、基孔肯雅熱

3、病毒核酸、黃熱病毒核酸、漢坦病毒核酸、乙型腦炎病毒核酸、流感病毒核酸（H1N1和H3N2）進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)檢測方法特異性。合成CCHFV目的基因質(zhì)粒DNA、構(gòu)建plv-CCHF重組慢病毒載體。對陽性對照假病毒顆粒進(jìn)行包裝，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。48小時(shí)后收集上清，用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測假病毒包裝情況。將構(gòu)建的假病毒加入核酸保護(hù)劑制備CCHFV陽性對照質(zhì)控品并進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)。應(yīng)用該方法檢測白云機(jī)場出入境的100例發(fā)熱患者血清。
　

4、　結(jié)果：
　　CCHFV的一步法熒光定量RT-PCR方法的靈敏度為7.26×102 copies/μl。方法特異性強(qiáng)，登革病毒核酸、基孔肯雅病毒核酸、黃熱病毒核酸、漢坦病毒核酸、乙型腦炎病毒核酸、流感病毒核酸（H1N1和 H3N2）均無特異性擴(kuò)增曲線。方法的重復(fù)性好，7.26×109copies/μl、7.26×107copies/μl CCHFV RNA模板重復(fù)測定五次無顯著差異。制備了可對CCHFV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR全程監(jiān)測