促排卵藥物對(duì)小鼠胚胎發(fā)育的影響及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：近30年來(lái)，輔助生殖技術(shù)（assistedreproductivetechnology,ART）在臨床上的廣泛使用使許多不育不孕夫婦有了自己的親生孩子。但是目前輔助生育技術(shù)的成功率比較低,而且臨床上ART后存在多胎妊娠率高引發(fā)高的母嬰病死。如何提高成功率是各個(gè)輔助生殖中心所要解決的問(wèn)題。為此各國(guó)生殖機(jī)構(gòu)人員致力于研究一種更接近生理過(guò)程的單個(gè)囊胚移植,希望能有效提高妊娠率、降低多胎率。
　　目前胚胎評(píng)估的方法還主要是采用形

2、態(tài)學(xué)評(píng)估，因?yàn)槭侨藶椴僮髟u(píng)估，難免有主觀因素介入。著床前胚胎遺傳學(xué)診斷（preimplantationgeneticdiagnosis，PGD）則對(duì)胚胎有損傷。因而繼續(xù)尋找無(wú)創(chuàng)的、客觀量化的胚胎評(píng)估方法預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育潛能成為目前生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域面臨的問(wèn)題之一。
　　超排卵（controlledovarianhyperstimulation,COH）是體外受精-胚胎移植（in-vitrofertilizationandembryotran

3、sfer,IVF-ET）技術(shù)中非常重要的方法,能募集卵母細(xì)胞，獲得恰當(dāng)數(shù)量的囊胚,為體外受精-胚胎移植技術(shù)廣泛順利開展提供了前提和保障。令人失望的是體外授精的受精率和卵裂率比較高，但是移植成功率很低，IVF胚胎多數(shù)發(fā)生移植失敗，只有少數(shù)胚胎能發(fā)育到活產(chǎn)。而且超排卵導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性降低，妊娠率明顯下降，胚胎質(zhì)量降低。目前，超排卵影響胚胎質(zhì)量和發(fā)育潛能的機(jī)制尚不明確，需要對(duì)其進(jìn)行深入研究。闡明促排卵藥物對(duì)胚胎發(fā)育的影響及其可能的機(jī)制，為尋

4、找有效的生物學(xué)標(biāo)記物進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育潛能提供了理論基礎(chǔ)。
　　研究目的：1采用ICR小鼠模型，通過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)體系，研究超排卵對(duì)囊胚發(fā)育、胚胎植入的影響。2通過(guò)基因芯片的方法，研究超排卵對(duì)小鼠囊胚基因表達(dá)譜的影響。3根據(jù)基因芯片的結(jié)果，選擇編碼分泌蛋白的差異基因，通過(guò)ELISA方法驗(yàn)證胚胎培養(yǎng)液中其分泌蛋白水平的變化，從而為開展早期胚胎的無(wú)創(chuàng)性臨床診斷提供新思路。
　　研究方法：1通過(guò)超排卵受孕與自然受孕獲取囊胚，采用體

5、視顯微鏡進(jìn)行囊胚形態(tài)學(xué)觀察，測(cè)量囊胚直徑并分級(jí)。2采用小鼠胚胎植入的體外模型，通過(guò)建立囊胚和子宮內(nèi)膜共培養(yǎng)體系，在24h,48h和72h采用體視顯微鏡觀察，比較自然受孕和超排受孕的囊胚在孵化、黏附和擴(kuò)展方面的差異。3應(yīng)用基因芯片雜交技術(shù)，研究超排卵對(duì)囊胚基因表達(dá)譜的影響。數(shù)據(jù)采用聚類分析、基因本體論（GeneOntology,GO）分析和京都基因與基因組百科全書（KyotoEncyclopediaOfGenesAndGenomes,KE

6、GG)分析等方法進(jìn)行處理。4通過(guò)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitativereal-timepolymerasechainreaction，qRTPCR）鑒定隨機(jī)選取的14個(gè)差異表達(dá)基因。5在差異基因中尋找編碼分泌蛋白的基因，采用酶聯(lián)免疫吸附法（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA）法檢測(cè)超排組和對(duì)照組胚胎培養(yǎng)液中IL-6蛋白的含量。
　　結(jié)果：1通過(guò)測(cè)量囊胚的直徑，發(fā)現(xiàn)超排組囊胚的直徑為1

7、45.3±76.9μm，與對(duì)照組（152.6±65.5μm）相比明顯減小，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明差異非常顯著（P<0.001）。此外，超排卵組囊胚細(xì)胞總數(shù)（68.9±6.9）亦明顯少于對(duì)照組囊胚細(xì)胞總數(shù)（76.8±7.9）（P<0.01）。形態(tài)學(xué)觀察進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，超排組中三級(jí)囊胚數(shù)為2.1±0.20，對(duì)照組為0.9±0.1，差異具有非常顯著性意義（P<0.01）。
　　2采用囊胚/子宮上皮細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)觀察24h,48h和72h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與

8、對(duì)照組相比，超排卵對(duì)胚泡孵化，黏附和擴(kuò)展的影響不大，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。
　　3基因芯片雜交結(jié)果顯示，和對(duì)照組相比，超排組囊胚一共有180個(gè)差異表達(dá)基因(≥1.5倍,p<0.01)，其中有108個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，72基因表達(dá)上調(diào)。有5個(gè)編碼分泌型蛋白的基因差異表達(dá)（IL-6、Efemp1、H2-K1、Ly96和Tgfbi）,其中IL-6，Efemp1和Tgfbi的功能是與胚胎發(fā)育相關(guān)的。
　　4qRT-PCR

9、結(jié)果顯示，隨機(jī)挑選的14個(gè)差異基因表達(dá)變化與相應(yīng)的微陣列實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。
　　5體外培養(yǎng)胚胎從0.5dpc發(fā)育到3.5dpc時(shí)，超排組胚胎培養(yǎng)液中IL-6含量為3.973±1.392，顯著低于正常組7.642±1.317，兩者比較差異具有非常顯著性意義（P<0.01）。并且培養(yǎng)液滴中IL-6含量越高，液滴中囊胚形成率越高。
　　結(jié)論：我們結(jié)果證實(shí)超排卵對(duì)胚胎質(zhì)量和發(fā)育有影響。表現(xiàn)在囊胚直徑減小、囊胚評(píng)估等級(jí)降低、但是胚胎植入

10、能力沒(méi)有發(fā)生改變。提示超排卵可能主要影響胚胎日后發(fā)育成胎兒部分的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，進(jìn)而進(jìn)一步影響胎兒的發(fā)育。
　　通過(guò)我們的研究首次發(fā)現(xiàn)超排卵引起小鼠囊胚180個(gè)基因表達(dá)改變，其中108個(gè)上調(diào)，72個(gè)下調(diào)，隨機(jī)選擇的14個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR鑒定，結(jié)果與基因芯片結(jié)果相一致。
　　研究中我們首次從差異表達(dá)的基因中找出了5個(gè)能編碼分泌蛋白的基因IL-6，H2-K1，ly96,Efemp1和Tgfbi，其中IL-6，Efemp1和Tgf

11、bi這3個(gè)基因的功能是與胚胎發(fā)育相關(guān)的。通過(guò)ELISA方法我們驗(yàn)證了超排卵能夠降低體外培養(yǎng)受精卵發(fā)育到囊胚時(shí)胚胎培養(yǎng)液中IL-6蛋白的水平，與超排卵降低IL-6基因表達(dá)相一致。同時(shí)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液滴中IL-6蛋白含量越高，液滴中囊胚形成率越高。
　　總之，差異表達(dá)基因的發(fā)現(xiàn)，為促排卵藥物對(duì)胚胎發(fā)育的影響提供了可能的機(jī)制。與胚胎發(fā)育有關(guān)的差異基因編碼的分泌型蛋白IL-6的發(fā)現(xiàn)和進(jìn)一步研究，為尋找有效的生物學(xué)標(biāo)記物進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育潛能提