促排卵藥物對小鼠胚胎發(fā)育的影響及機制研究.pdf

1、研究背景：近30年來，輔助生殖技術（assistedreproductivetechnology,ART）在臨床上的廣泛使用使許多不育不孕夫婦有了自己的親生孩子。但是目前輔助生育技術的成功率比較低,而且臨床上ART后存在多胎妊娠率高引發(fā)高的母嬰病死。如何提高成功率是各個輔助生殖中心所要解決的問題。為此各國生殖機構人員致力于研究一種更接近生理過程的單個囊胚移植,希望能有效提高妊娠率、降低多胎率。
　　目前胚胎評估的方法還主要是采用形

2、態(tài)學評估，因為是人為操作評估，難免有主觀因素介入。著床前胚胎遺傳學診斷（preimplantationgeneticdiagnosis，PGD）則對胚胎有損傷。因而繼續(xù)尋找無創(chuàng)的、客觀量化的胚胎評估方法預測胚胎發(fā)育潛能成為目前生殖醫(yī)學領域面臨的問題之一。
　　超排卵（controlledovarianhyperstimulation,COH）是體外受精-胚胎移植（in-vitrofertilizationandembryotran

3、sfer,IVF-ET）技術中非常重要的方法,能募集卵母細胞，獲得恰當數(shù)量的囊胚,為體外受精-胚胎移植技術廣泛順利開展提供了前提和保障。令人失望的是體外授精的受精率和卵裂率比較高，但是移植成功率很低，IVF胚胎多數(shù)發(fā)生移植失敗，只有少數(shù)胚胎能發(fā)育到活產。而且超排卵導致子宮內膜容受性降低，妊娠率明顯下降，胚胎質量降低。目前，超排卵影響胚胎質量和發(fā)育潛能的機制尚不明確，需要對其進行深入研究。闡明促排卵藥物對胚胎發(fā)育的影響及其可能的機制，為尋

4、找有效的生物學標記物進行準確預測胚胎發(fā)育潛能提供了理論基礎。
　　研究目的：1采用ICR小鼠模型，通過體內體外實驗體系，研究超排卵對囊胚發(fā)育、胚胎植入的影響。2通過基因芯片的方法，研究超排卵對小鼠囊胚基因表達譜的影響。3根據(jù)基因芯片的結果，選擇編碼分泌蛋白的差異基因，通過ELISA方法驗證胚胎培養(yǎng)液中其分泌蛋白水平的變化，從而為開展早期胚胎的無創(chuàng)性臨床診斷提供新思路。
　　研究方法：1通過超排卵受孕與自然受孕獲取囊胚，采用體

5、視顯微鏡進行囊胚形態(tài)學觀察，測量囊胚直徑并分級。2采用小鼠胚胎植入的體外模型，通過建立囊胚和子宮內膜共培養(yǎng)體系，在24h,48h和72h采用體視顯微鏡觀察，比較自然受孕和超排受孕的囊胚在孵化、黏附和擴展方面的差異。3應用基因芯片雜交技術，研究超排卵對囊胚基因表達譜的影響。數(shù)據(jù)采用聚類分析、基因本體論（GeneOntology,GO）分析和京都基因與基因組百科全書（KyotoEncyclopediaOfGenesAndGenomes,KE

6、GG)分析等方法進行處理。4通過實時定量聚合酶鏈反應（quantitativereal-timepolymerasechainreaction，qRTPCR）鑒定隨機選取的14個差異表達基因。5在差異基因中尋找編碼分泌蛋白的基因，采用酶聯(lián)免疫吸附法（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay,ELISA）法檢測超排組和對照組胚胎培養(yǎng)液中IL-6蛋白的含量。
　　結果：1通過測量囊胚的直徑，發(fā)現(xiàn)超排組囊胚的直徑為1

7、45.3±76.9μm，與對照組（152.6±65.5μm）相比明顯減小，統(tǒng)計結果表明差異非常顯著（P<0.001）。此外，超排卵組囊胚細胞總數(shù)（68.9±6.9）亦明顯少于對照組囊胚細胞總數(shù)（76.8±7.9）（P<0.01）。形態(tài)學觀察進一步發(fā)現(xiàn)，超排組中三級囊胚數(shù)為2.1±0.20，對照組為0.9±0.1，差異具有非常顯著性意義（P<0.01）。
　　2采用囊胚/子宮上皮細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)觀察24h,48h和72h，結果發(fā)現(xiàn)，與

8、對照組相比，超排卵對胚泡孵化，黏附和擴展的影響不大，兩者差異無統(tǒng)計學意義（p>0.05）。
　　3基因芯片雜交結果顯示，和對照組相比，超排組囊胚一共有180個差異表達基因(≥1.5倍,p<0.01)，其中有108個基因表達下調，72基因表達上調。有5個編碼分泌型蛋白的基因差異表達（IL-6、Efemp1、H2-K1、Ly96和Tgfbi）,其中IL-6，Efemp1和Tgfbi的功能是與胚胎發(fā)育相關的。
　　4qRT-PCR

9、結果顯示，隨機挑選的14個差異基因表達變化與相應的微陣列實驗結果相一致。
　　5體外培養(yǎng)胚胎從0.5dpc發(fā)育到3.5dpc時，超排組胚胎培養(yǎng)液中IL-6含量為3.973±1.392，顯著低于正常組7.642±1.317，兩者比較差異具有非常顯著性意義（P<0.01）。并且培養(yǎng)液滴中IL-6含量越高，液滴中囊胚形成率越高。
　　結論：我們結果證實超排卵對胚胎質量和發(fā)育有影響。表現(xiàn)在囊胚直徑減小、囊胚評估等級降低、但是胚胎植入

10、能力沒有發(fā)生改變。提示超排卵可能主要影響胚胎日后發(fā)育成胎兒部分的內細胞團，進而進一步影響胎兒的發(fā)育。
　　通過我們的研究首次發(fā)現(xiàn)超排卵引起小鼠囊胚180個基因表達改變，其中108個上調，72個下調，隨機選擇的14個基因進行qRT-PCR鑒定，結果與基因芯片結果相一致。
　　研究中我們首次從差異表達的基因中找出了5個能編碼分泌蛋白的基因IL-6，H2-K1，ly96,Efemp1和Tgfbi，其中IL-6，Efemp1和Tgf

11、bi這3個基因的功能是與胚胎發(fā)育相關的。通過ELISA方法我們驗證了超排卵能夠降低體外培養(yǎng)受精卵發(fā)育到囊胚時胚胎培養(yǎng)液中IL-6蛋白的水平，與超排卵降低IL-6基因表達相一致。同時發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液滴中IL-6蛋白含量越高，液滴中囊胚形成率越高。
　　總之，差異表達基因的發(fā)現(xiàn)，為促排卵藥物對胚胎發(fā)育的影響提供了可能的機制。與胚胎發(fā)育有關的差異基因編碼的分泌型蛋白IL-6的發(fā)現(xiàn)和進一步研究，為尋找有效的生物學標記物進行準確預測胚胎發(fā)育潛能提