microRNAs參與葉酸缺乏影響小鼠胚胎發(fā)育調(diào)控機制的初步研究.pdf

1、胚胎發(fā)育是一個復(fù)雜的過程,受到遺傳與環(huán)境的交互調(diào)控。葉酸作為一種水溶性維生素,參與一碳單位的循環(huán)代謝、DNA的合成與甲基化,因此在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。之前研究表明葉酸缺乏可抑制正常的胚胎發(fā)育,如引起神經(jīng)管畸形,此外還可在個體成年后引起腫瘤發(fā)生。microRNAs(miRNAs)是一類長約17-24個核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA,通過與靶mRNA完全或不完全互補配對,導(dǎo)致靶 mRNA降解或抑制其翻譯,參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。目前

2、miRNAs已被證實參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、細(xì)胞周期進(jìn)展等生理過程。然而,葉酸缺乏如何影響胚胎發(fā)育過程及其具體調(diào)控機制仍不明確,miRNAs是否參與調(diào)控此過程仍需證實。
　　目的
　　1.以小鼠胚胎干細(xì)胞為模型,以細(xì)胞增殖和凋亡為切入點,探究葉酸缺乏對胚胎發(fā)育的影響以及潛在的調(diào)控機制;特別是miRNAs的調(diào)控功能;
　　2.為研究早期胚胎發(fā)育中的調(diào)控機制提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法
　　1.小鼠胚胎干細(xì)胞

3、分別置于完全培養(yǎng)基和無葉酸培養(yǎng)基中(正常葉酸組與葉酸缺乏組)培養(yǎng)96h;采用 CCK-8法檢測葉酸對小鼠胚胎干細(xì)胞增殖活性的影響;流式細(xì)胞學(xué)方法檢測細(xì)胞早期凋亡率及周期分布變化;實時熒光定量PCR法和免疫印記法檢測Caspase-3表達(dá)變化情況;
　　2.采用基因芯片技術(shù)檢測兩組細(xì)胞miRNAs及mRNAs差異表達(dá)譜;選取與小鼠胚胎干細(xì)胞增殖和凋亡及細(xì)胞周期相關(guān)的特異性 miRNAs,采用莖環(huán)實時熒光定量PCR方法驗證顯著差異表達(dá)

4、的miRNAs;
　　3.采用TargetScan6.0(mouse)軟件預(yù)測特異性miRNAs的靶基因,其與mRNAs表達(dá)譜芯片結(jié)果取負(fù)相關(guān),獲取一組表達(dá)差異的mRNAs;構(gòu)建 miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)圖;交集基因顯著靶向性功能分析(Gene Ontology,GO),構(gòu)建miRNA-GO網(wǎng)絡(luò)圖,最終確定關(guān)鍵miRNA和mRNA;
　　4.采用TargetScan6.0( mouse)軟件預(yù)測關(guān)鍵miRNA對其關(guān)鍵靶基因的

5、潛在調(diào)控位點,同時雙熒光素酶報告基因方法驗證關(guān)鍵miRNA對其關(guān)鍵靶基因3'UTR區(qū)的調(diào)控作用;
　　5.采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法,在葉酸缺乏組細(xì)胞中上調(diào)關(guān)鍵miRNA的表達(dá),通過流式細(xì)胞學(xué)、實時熒光定量PCR法、免疫印記法研究關(guān)鍵miRNA對小鼠胚胎干細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期分布的影響。
　　結(jié)果
　　1.與正常葉酸組相比,小鼠胚胎干細(xì)胞葉酸缺乏培養(yǎng)72h后增殖能力明顯下降( P<0.01),早期凋亡率明顯增加(P<0.01

6、),細(xì)胞周期在 G0/G1期阻滯, Caspase-3在mRNA和蛋白水平表達(dá)均顯著上調(diào);
　　2. miRNA表達(dá)譜芯片顯示:與正常葉酸組相比,小鼠胚胎干細(xì)胞葉酸缺乏培養(yǎng)72h后,miRNA和 mRNA表達(dá)譜均存在顯著差異,其中包括60個表達(dá)上調(diào) miRNAs和34個表達(dá)下調(diào) miRNAs,2316個表達(dá)上調(diào)的mRNAs和2544個表達(dá)下調(diào)的mRNAs;選取12個miRNA進(jìn)行驗證,檢測結(jié)果與芯片結(jié)果一致,其中l(wèi)et-7a, m

7、iR-15a,miR-15b,miR-16,miR-29a,miR-29b,miR-34a,miR-130b,miR-125a-5p, miR-124表達(dá)顯著上調(diào),miR-290, miR-302a表達(dá)顯著下調(diào);
　　3.356個靶基因參與miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)圖中,295個GOs參與miRNA-GO網(wǎng)絡(luò)圖;其中在表達(dá)上調(diào)顯著性GOs中,富集度最高的為小G蛋白介導(dǎo)的信號通路,在表達(dá)下調(diào)顯著性GOs中,富集度最高的為G1/S期轉(zhuǎn)換

8、過程;最終miR-302a與其靶基因Lats2分別被選定為關(guān)鍵miRNA和mRNA;
　　4. Lats2基因3'UTR包含兩個 miR-302a結(jié)合位點,雙熒光素酶報告實驗表明miR-302a能夠靶向調(diào)控Lats2基因的3'UTR;實時熒光定量PCR方法和免疫印跡法進(jìn)一步證實miR-302a能夠調(diào)控內(nèi)源性Lats2基因的表達(dá);
　　5.與轉(zhuǎn)染對照組相比,轉(zhuǎn)染miR-302a mimics后細(xì)胞克隆明顯增大,早期凋亡率及晚期