斑馬魚cd99l2的時(shí)空表達(dá)及其在早期造血意義的研究.pdf

1、研究背景：
　　 人類CD99是一個(gè)分子量32kDa的糖基化跨膜蛋白,由位于X和Y染色體短臂假染色體區(qū)(PAR,Xp22.32-pter和Yp11-pter)的MIC2基因所編碼,其功能至今未明確。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)在人類骨髓、胸腺及外周血中的細(xì)胞均有CD99的表達(dá),而且表達(dá)的水平與細(xì)胞的成熟程度密切相關(guān),未成熟的細(xì)胞要高于成熟細(xì)胞。CD99在未成熟血細(xì)胞高表達(dá)現(xiàn)象是否提示它在血細(xì)胞的分化、發(fā)育的過(guò)程中起重要的調(diào)控作用?與哪些調(diào)控因

2、子相關(guān)?怎樣的調(diào)控機(jī)制?這些問(wèn)題引起了我們極大興趣。
　　 造血過(guò)程是各種血細(xì)胞的分化、發(fā)育、成熟的過(guò)程,是一個(gè)多階段、多步驟、受多種因子調(diào)控的復(fù)雜而有序的動(dòng)態(tài)過(guò)程。已有證據(jù)表明人和小鼠的成體造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells,HSCs)是成體內(nèi)各系造血細(xì)胞的來(lái)源,單個(gè)HSC即可在合適的宿主體內(nèi)重建整個(gè)造血系統(tǒng)。人類造血干細(xì)胞增殖分化是按照嚴(yán)格的等級(jí)制度進(jìn)行的,并受不同的造血生長(zhǎng)調(diào)控因子調(diào)控。首先由多能

3、造血干細(xì)胞自我增殖后,一支向淋系造血祖細(xì)胞(common lymphoid progenitor,CLP)分化,隨后分化成熟成為外周淋巴細(xì)胞；另一支向髓系造血祖細(xì)胞(commonmyeloid progenitors,CMP)發(fā)育成熟為外周血細(xì)胞如粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板。盡管人類對(duì)造血的起源、分化、發(fā)育、增殖、成熟等過(guò)程進(jìn)行了大量的研究,至今未獲得人類造血干細(xì)胞形態(tài)學(xué)的直接證據(jù),對(duì)這些調(diào)控機(jī)制更是不甚明確。小鼠是公認(rèn)最好的模式

4、生物之一,但由于它是胚胎子宮內(nèi)發(fā)育,難以對(duì)早期造血進(jìn)行快速連續(xù)的觀察,因此一定程度限制了在早期胚胎造血領(lǐng)域的研究。近年來(lái),一種叫斑馬魚(zebrafish or Danio rerio)的模式生物迅速吸引了全世界大批實(shí)驗(yàn)室和科學(xué)家。它與人類基因組同源性高,血細(xì)胞組份與人類相似,同樣具有紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及血小板,其造血過(guò)程高度保守,與高等脊椎動(dòng)物具有一致性:(1)造血過(guò)程一致性,均包含原始造血和定向造血兩個(gè)過(guò)程；(2)調(diào)

5、節(jié)區(qū)域基本一致,具有相似的造血區(qū)域；(3)信號(hào)通路方面也具有一致性。與小鼠相比它體外受精、體外發(fā)育、透明可視、胚胎容易獲得,因此非常適合作為研究早期胚胎造血的模式生物。為此本研究以斑馬魚作為模式生物,探究斑馬魚cd99l2(Danio rerio CD99antigen-like 2,NM 194369)在斑馬魚血細(xì)胞的分化、發(fā)育的過(guò)程中作用,為探索人類CD99在造血過(guò)程的功能提供線索。
　　 人類CD99在斑馬魚的直系同源基因

6、(Orthology)cd99l2的跨膜區(qū)域氨基酸序列與人類CD99有著58％的一致性和98％的相似性,因此通過(guò)研究斑馬魚cd99l2的功能來(lái)揭示人類CD99在血細(xì)胞的分化、發(fā)育過(guò)程的功能成為了可能。為研究cd99l2在斑馬魚造血的功能,首先要熟悉胚胎發(fā)育過(guò)程中cd99l2基因表達(dá)的時(shí)間及位置。由于目前尚無(wú)商品化的cd99l2抗體,我們無(wú)法從檢測(cè)cd99l2的蛋白入手,為此我們采用整體原位雜交技術(shù)(whole-mount in situ

7、 hybridization,WISH)檢測(cè)cd99l2在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá),該雜交技術(shù)不同于一般在載片上對(duì)細(xì)胞和組織切片進(jìn)行雜交,而是對(duì)完整的斑馬魚胚胎進(jìn)行探針雜交及檢測(cè),在整體水平上精確地觀測(cè)胚胎發(fā)育過(guò)程中基因表達(dá)的三維信息。與切片雜交相比,其最大的特點(diǎn)在于整體性,它可以較直觀全面地看到基因的表達(dá)部位。因?yàn)閃ISH是檢測(cè)整個(gè)胚胎,包含了相應(yīng)階段所有的轉(zhuǎn)錄子,對(duì)探針長(zhǎng)度的要求較高,為了保證雜交的特異性,我們采用體外轉(zhuǎn)錄的方式自行制備地高辛

8、標(biāo)記的反義cd99l2探針。在探針的有效性得到保證后,采用WISH技術(shù)連續(xù)觀測(cè)了cd99l2的時(shí)空表達(dá),發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的信號(hào)區(qū)域,經(jīng)分析可能是早期造血的部位,于是引入3個(gè)與造血密切相關(guān)的突變體cloche,scl和moonshine,探究cd99l2時(shí)空表達(dá)與早期造血的關(guān)系。cloche的突變體,該突變體是某一基因突變后導(dǎo)致cloche突變體純合子很早期即發(fā)生嚴(yán)重的造血缺陷,幾乎沒(méi)有任何的血細(xì)胞,同時(shí)成血管細(xì)胞(angioblast)消失

9、、血管形成障礙。scl的突變體,該突變體是干細(xì)胞白血病基因(Stem cell leukemia,SCL)突變所致,該基因在造血過(guò)程中具有極為重要的作用,它的突變直接導(dǎo)致scl突變體純合了發(fā)生嚴(yán)重的造血缺陷,幾乎不生成任何的血細(xì)胞,同時(shí)血管形成障礙,但其成血管細(xì)胞存在。moonshine的突變體,該突變體為造血較晚期的調(diào)控基因mon發(fā)生了突變,出現(xiàn)原始及永久造血中紅系缺失,而其他譜系及血管生成均正常。我們分別驗(yàn)證了3個(gè)突變體的各譜系的造

10、血情況,包括紅系(βe1,O-dianisidine染色)、髓系(lyc,蘇丹黑染色)、淋系(rag1)、血管及成血管細(xì)胞(fli1)的檢測(cè),利用三個(gè)突變體在不同階段的造血障礙,分析cd99l2與斑馬魚早期造血的關(guān)系。
　　 本研究通過(guò)以下三部分進(jìn)行:
　　 第一部分 地高辛標(biāo)記斑馬魚cd99l2基因RNA探針的制備
　　 1.目的:制備用于檢測(cè)斑馬魚胚胎早期cd99l2基因時(shí)空表達(dá)的地高辛標(biāo)記RNA探針。

11、>　　 2.方法:設(shè)計(jì)引物,構(gòu)建cd99l2/pGM-T重組質(zhì)粒,用SacII酶切得到線性化DNA片段,以Sp6 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄合成地反義地高辛標(biāo)記的RNA探針,采用WISH檢測(cè)斑馬魚胚胎早期cd99l2基因的表達(dá),驗(yàn)證探針的有效性。
　　 3.結(jié)果:成功地構(gòu)建了cd99l2/pGM-T重組質(zhì)粒,并體外轉(zhuǎn)錄獲得反義RNA探針。
　　 4.結(jié)論:本章節(jié)制備的反義cd99l2 RNA探針,由于其長(zhǎng)度達(dá)600bp以上,

12、帶有上百個(gè)地高辛,因此具有較高的特異性,較弱的表達(dá)也能有效檢測(cè)。
　　 第二部分 cd99l2在胚胎發(fā)育過(guò)程中時(shí)空表達(dá)模式的研究
　　 1.目的:通過(guò)不同時(shí)間和不同部位表達(dá)的變化,在整體水平上構(gòu)建胚胎發(fā)育過(guò)程中cd99l2基因表達(dá)的三維結(jié)構(gòu),為后續(xù)研究該基因的功能提供信息。
　　 2.方法:收集各個(gè)時(shí)期的胚胎,WISH檢測(cè)cd99l2基因的mRNA的時(shí)空表達(dá)。
　　 3.結(jié)果:成功構(gòu)建cd99l2時(shí)空表達(dá)

13、模式,除了與文獻(xiàn)報(bào)道的在中樞神經(jīng)系統(tǒng)高表達(dá)之外,我們發(fā)現(xiàn)了新的與ICM造血區(qū)域相似的表達(dá)區(qū)域。
　　 4.結(jié)論:新發(fā)現(xiàn)的表達(dá)信號(hào)可能為造血區(qū)域中某種細(xì)胞或其前體細(xì)胞,也可能是成血管細(xì)胞。
　　 第三部分 斑馬魚cd99l2與胚胎早期造血關(guān)系的研究
　　 1.目的:明確cd99l2在斑馬魚胚胎早期造血中的意義。
　　 2.方法:利用cloche、scl、moonshine3個(gè)突變體驗(yàn)證cd99l2與早期造血