MYCN轉(zhuǎn)基因斑馬魚對造血調(diào)控因子的影響.pdf

1、目的和意義： MYCN基因是myc基因家族的重要成員之一，與c-myc保持高度同源性，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化及惡性轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。大量研究證實(shí)除了神經(jīng)源性腫瘤，MYCN癌基因也與血液系統(tǒng)腫瘤密切相關(guān)，但與疾病發(fā)生機(jī)制的關(guān)系仍不確切。因此我們利用新興的模式生物斑馬魚，通過熱激活啟動(dòng)子條件性過表達(dá)鼠源性MYCN基因，建立生殖系穩(wěn)轉(zhuǎn)的斑馬魚系，以研究MYCN基因?qū)υ煅δ艿霓D(zhuǎn)錄調(diào)控，為將來進(jìn)一步研究白血病發(fā)病機(jī)制和藥物篩選奠定基礎(chǔ)。
　　

2、 實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果：首先構(gòu)建了攜綠色熒光蛋白“報(bào)告基因”的MYCN-PSGH2表達(dá)質(zhì)粒，并將其顯微注射到斑馬魚胚胎單細(xì)胞期，將胚胎培養(yǎng)至性成熟，并與野生型交配產(chǎn)卵，通過熒光篩選出F0代(F0 founder)，繼而建立生殖系穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)基因魚系至F2代。在性成熟256條嵌合表達(dá)的F0代中我們鑒定得到18條(7.0％)轉(zhuǎn)基因陽性F0代，其中雄魚8條，雌魚10條。在轉(zhuǎn)基因的表達(dá)論證上，我們通過大體觀及分子水平RT-PCR證實(shí)了MYCN基因在

3、轉(zhuǎn)基因斑馬魚中的過表達(dá)；在表型鑒定上，由于斑馬魚在造血調(diào)控過程中，各系形態(tài)學(xué)和關(guān)鍵造血調(diào)控因子的表達(dá)與哺乳動(dòng)物高度保守，因此我們通過熒光實(shí)時(shí)定量PCR(RFQ-PCR)檢測一些在斑馬魚中較為重要的造血轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量變化。發(fā)現(xiàn)與野生型相比，轉(zhuǎn)基因斑馬魚F1和F2代紅系造血調(diào)控因子gata1明顯下調(diào)，除此之外髓系的mpo、造血干細(xì)胞的scl表達(dá)量也明顯下降，表明粒系造血分化發(fā)生障礙，這些結(jié)果與外周血涂片結(jié)果相一致。
　　 結(jié)論：構(gòu)建