核酸識體熒光光譜法研究及其關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建.pdf

1、核酸識體(aptamer)是近年來發(fā)展起來的一類經(jīng)體外人工進(jìn)化程序篩選出的寡聚核苷酸。它能高效、特異地結(jié)合各種配體，具有易合成、易儲存、易修飾等優(yōu)點(diǎn)。核酸識體的出現(xiàn)突破了傳統(tǒng)意義上關(guān)于核酸的功能只是遺傳信息存儲和轉(zhuǎn)運(yùn)載體的認(rèn)識，以及與蛋白質(zhì)特異識別的配體通常只能由抗體來完成的現(xiàn)狀。核酸識體藉自身折疊成特有的空間結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)、藥物分子等特異高效地結(jié)合，其解離常數(shù)很小，可達(dá)nM或pM級。因此，越來越多的人關(guān)注核酸識體在分子檢測、藥物分子設(shè)計(jì)

2、以及醫(yī)療診斷等方面的應(yīng)用。目前，發(fā)展無須分離洗脫樣品、在均相溶液中快速實(shí)時檢測混合組分中靶分子的信號核酸識體是較為活躍的研究方向之一。熒光方法因其簡單易行、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為最常用的分子檢測方法。目前常用的是通過單標(biāo)記及雙標(biāo)記熒光基團(tuán)兩種方法。例如通過檢測靶分子誘導(dǎo)的熒光各向異性或熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)變化來檢測生理?xiàng)l件下癌蛋白PDGF-BB(platelet-derived growthfactoI BB)。但是標(biāo)

3、記熒光基團(tuán)有可能會削弱核酸識體對配體的識別能力，而且實(shí)驗(yàn)的成本也會較高，尤其對于RNA核酸識體，標(biāo)記熒光基團(tuán)是較困難的。但是目前篩選出的核酸識體，大部分都是RNA核酸識體，使核酸識體在蛋白質(zhì)的檢測及生物傳感器的應(yīng)用方面受到限制。這樣就非常需要發(fā)展各種非標(biāo)記的分析方法。目前這方面的報(bào)道很少，而且方法也不具有普遍性。 隨著化學(xué)信息、生物信息如蛋白質(zhì)序列等的持續(xù)增長，如何更好地表示、存貯、檢索、傳遞、挖掘和利用這些信息資源已成為我們

4、不可回避的問題。目前研究的熱點(diǎn)大致分兩個方面：一方面是開發(fā)具有用戶界面統(tǒng)一、使用方便、易擴(kuò)充、易于檢索等特點(diǎn)的數(shù)據(jù)庫，以實(shí)現(xiàn)信息資源的提取、轉(zhuǎn)化與共享。國內(nèi)這一領(lǐng)域雖然起步較晚，但已經(jīng)有了一定的發(fā)展。如我們實(shí)驗(yàn)室先后構(gòu)建了西部植物資源數(shù)據(jù)庫、西部天然藥物網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫和常用化學(xué)資源數(shù)據(jù)庫，并對西部天然藥物網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫中的中藥活性成分進(jìn)行了數(shù)據(jù)庫的二次開發(fā)。另一方面是加強(qiáng)大規(guī)模處理數(shù)據(jù)和信息的能力，從中獲得物質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能的相關(guān)信息，揭示化學(xué)和生

5、物等信息的內(nèi)在實(shí)質(zhì)與內(nèi)在聯(lián)系，在分子水平上為人體生理、病理過程提供理論依據(jù)。如在生物學(xué)中，由蛋白質(zhì)序列到功能或從結(jié)構(gòu)到功能的研究是理解蛋白質(zhì)分子進(jìn)化及開展蛋白質(zhì)工程研究的有利工具。目前蛋白質(zhì)序列及結(jié)構(gòu)分析方法主要分為兩類，一類基于統(tǒng)計(jì)模型，如根據(jù)氨基酸進(jìn)化概率建立的PAM、BLOSUM矩陣和由此提出的序列比對方法以及數(shù)據(jù)庫檢索方法。另一類是結(jié)合信號處理的學(xué)習(xí)器用于蛋白質(zhì)序列分析，如基于小波變換神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法、基于傅立葉變換神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法，以

6、及基于傅立葉變換支持向量機(jī)方法等等已被廣泛的用于生物信號處理上。其中支持向量機(jī)作為基于統(tǒng)計(jì)學(xué)習(xí)原理的學(xué)習(xí)器，它的優(yōu)點(diǎn)主要表現(xiàn)在總是尋找全局最優(yōu)，避免過擬合，以及善于處理參數(shù)多、樣本少的數(shù)據(jù)集，并有較好的泛化能力，已經(jīng)成為蛋白序列分析的重要工具。 本文圍繞核酸識體的應(yīng)用和化學(xué)生物數(shù)據(jù)庫的設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)兩方面開展了以下工作： 1．信號核酸識體能簡便、快速地實(shí)時檢測疾病相關(guān)的蛋白，因?yàn)樾盘柡怂嶙R體引起了研究者越來越多的興趣。本文擬

7、發(fā)展一種用商業(yè)化DNA插入型染料的信號核酸識體的新蛋白檢測方法。以檢測一種潛在的癌標(biāo)記物，癌蛋白PDGF-BB為例。利用核酸識體與PDGF-BB的高親和力以及aptamer／TOTO信號復(fù)合物對蛋白成鍵前后熒光變化的敏感，在生理?xiàng)l件下高選擇性和高靈敏度地檢測PDGF-BB。檢測限0.1 nmol·L<'-1>優(yōu)于已報(bào)道的基于核酸識體的其他方法。該方法非常簡便，無需共價標(biāo)記的核酸識體或合成探針，為癌探針或其他蛋白的分析和檢測的信號轉(zhuǎn)換機(jī)理

8、提供廣泛的應(yīng)用。 2．發(fā)展了一種利用RNA核酸識體和光開關(guān)化合物[Ru(phen)<,2>dppz]<'2+>高靈敏檢測藥物分子的熒光分析新方法。以藥物分子托普霉素為靶分子，實(shí)現(xiàn)了在生理?xiàng)l件下高選擇性和高靈敏度地檢測，檢測限可達(dá)10 nmol·L<'-1>。該方法能在溶液中實(shí)現(xiàn)無需分離的實(shí)時檢測。這種無標(biāo)記檢測方法有利于不穩(wěn)定RNA核酸識體在分析檢測中的應(yīng)用，簡化實(shí)驗(yàn)操作，為其他藥物分子的檢測提供了新思路。 3．利用熒光

9、光譜法研究了藥物與核糖核酸的相互作用。利用光開關(guān)化合物[Ru(phen)2dppz]<'2+>作為熒光探針試劑，以藥物分子托普霉素為研究對象，在模擬體液pH條件下(pH7.4)，討論藥物分子托普霉素與其RNA核酸識體的相互作用及作用機(jī)理。結(jié)果表明，在模擬體液pH條件下，藥物分子托普霉素可直接與其RNA核酸識體相互作用，其作用方式表現(xiàn)為溝槽方式和靜電作用的混合模式。這一研究結(jié)果為托普霉素的藥用機(jī)理提供了一定的理論參考和臨床應(yīng)用依據(jù)。

10、 4．設(shè)計(jì)并實(shí)現(xiàn)化學(xué)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫。以MySQL作為數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng)，選用中藥數(shù)據(jù)(天然藥物)為數(shù)據(jù)源，采用PERL為CGI開發(fā)工具，利用化學(xué)計(jì)量學(xué)算法和三維結(jié)構(gòu)搜索開發(fā)了化學(xué)軟件包，建立了WEB中的化學(xué)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫。 5．PDGF族一直被認(rèn)為是調(diào)控胚胎發(fā)展、異化、細(xì)胞增長和包括惡性腫瘤在內(nèi)許多疾病的重要因子。本文擬利用快速傅立葉變換與支持向量機(jī)學(xué)習(xí)器對PDGF家族進(jìn)行分類與預(yù)測。討論了傅立葉變換數(shù)據(jù)點(diǎn)(1024個點(diǎn)，512個點(diǎn)，25

11、6個點(diǎn)，128個點(diǎn))、氨基酸參數(shù)(c—p—v模型、疏水參數(shù)模型(FHφ，KDHφ，MHφ)以及EIIP模型)等對預(yù)測能力的影響。利用優(yōu)化得到的最佳氨基酸序列一疏水性替代模型和512個點(diǎn)作為傅立葉變換數(shù)據(jù)點(diǎn)建立PDGF蛋白頻率譜，用留一法建立四個支持向量機(jī)分類器用于PDGF家族的預(yù)測，得到全局準(zhǔn)確率和MCC分別為0,86和O.9l，證明該方法能較準(zhǔn)確預(yù)測PDGF四類家族。由于目前還沒有對PDGF家族進(jìn)行分類與預(yù)測方法報(bào)道，我們的工作希望能