利用生物工程技術(shù)培育高羊茅耐鹽耐旱新品系.pdf

1、高羊茅(Fescue arundinacea Schreb)是廣泛種植的多年生、開(kāi)放授粉的優(yōu)良草坪草兼牧草，具有色美、抗寒、耐蔭、耐修剪等優(yōu)點(diǎn)，在我國(guó)北方地區(qū)多被用于建造草坪，但其葉片粗糙、生長(zhǎng)緩慢、耐鹽性差及易受雜草危害等缺點(diǎn)限制了它的進(jìn)一步推廣。開(kāi)放授粉采用常規(guī)育種技術(shù)對(duì)高羊茅進(jìn)行種質(zhì)改良不僅周期長(zhǎng)、成效低，而且缺乏必要的遺傳背景知識(shí)。植物細(xì)胞工程和基因工程技術(shù)的發(fā)展為改良高羊茅的耐鹽性及耐早性提供了一條新途徑。 本工作以高

2、羊茅無(wú)菌種子苗莖尖為材料，在附加適宜濃度6-BA和2,4-D的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)叢生芽發(fā)生并繼代培養(yǎng)，建立起高效的叢生芽離體培養(yǎng)體系。 以叢生芽芽尖為受體，利用根瘤農(nóng)桿茵(菌株LBA4404，攜帶mini-Ti質(zhì)粒pCAMBIAl300。PIS-als)介導(dǎo)法將來(lái)源于玉米的PIS基因轉(zhuǎn)入高羊茅，獲得抗性芽?？剐匝款l率約為23.7﹪。抗性芽經(jīng)增殖后，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基生根，移栽花盆成活率達(dá)到95﹪以上。對(duì)轉(zhuǎn)化植株DNA進(jìn)行PCR和PCR-

3、Southem blotting檢測(cè)，證實(shí)PIS基因已轉(zhuǎn)入3個(gè)高羊茅品種中。對(duì)轉(zhuǎn)化參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)芽尖在OD<,600>=0.8-1.2的農(nóng)桿菌菌液中浸染5分種，結(jié)合負(fù)壓(0.5×10<'5>pa)處理，然后共培養(yǎng)2天，經(jīng)抑菌和綠黃隆篩選后獲得抗性芽頻率較高。 本實(shí)驗(yàn)室以繼代培養(yǎng)的叢生芽塊為材料，經(jīng)過(guò)連續(xù)加鹽篩選、后代選育，獲得了一批耐鹽株系。本工作對(duì)部分耐鹽株系進(jìn)行了耐鹽耐旱性分析。移栽到沙盆中的材料經(jīng)不同濃度鹽水澆灌后，

4、隨NaCl濃度的提高，材料的增殖能力逐漸減弱，脯氨酸含量提高。與對(duì)照相比，株系L53和L98分蘗增殖能力受鹽脅迫影響較小。對(duì)移栽到土鹽中的材料進(jìn)行干旱脅迫，并在脅迫不同時(shí)間取材測(cè)定生理指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比，株系L53、Q71和L98葉片細(xì)胞膜受到的損傷程度較輕，葉綠素含量降低的速度較慢，表現(xiàn)出較對(duì)照好的耐早性，其它多項(xiàng)生理指標(biāo)也支持了上述結(jié)論?？梢?jiàn)，株系L53和L98耐鹽耐旱性比較好，可作為進(jìn)‘步選育耐鹽耐旱高羊茅新品種的候選材料。

5、 另外對(duì)已獲得的轉(zhuǎn)betA的高羊茅株系進(jìn)行了耐鹽耐旱性分析。以兩個(gè)基因型各三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照為材料，鹽處理時(shí)，逐漸增加鹽濃度，達(dá)到終濃度后維持終濃度20天左右，選取不同時(shí)間點(diǎn)取材測(cè)生理指標(biāo)。干旱處理時(shí)，維持對(duì)材料適度脅迫即植株上午10時(shí)左右出現(xiàn)萎蔫，下午澆適量水后第二天早晨植株恢復(fù)正常，在脅迫不同時(shí)間點(diǎn)取材測(cè)定生理指標(biāo)。通過(guò)分析轉(zhuǎn)基因材料的生物量、葉綠素含量、脯氨酸含量、質(zhì)膜穩(wěn)定性等指標(biāo)，可以看出轉(zhuǎn)基因植株比對(duì)照具有更好的耐鹽耐旱