利用AhCMO、AhBADH和AtNEK6基因提高植物耐旱、耐鹽性的研究.pdf

1、我國是一個農(nóng)業(yè)大國，作物增產(chǎn)、農(nóng)民增收和糧食安全是保障我國經(jīng)濟和社會發(fā)展的重要基礎(chǔ)。但是，由于人口不斷增加和農(nóng)業(yè)用地面積逐年減少等原因，導(dǎo)致我國人口與土地資源的矛盾日益突出，這一矛盾為棉花育種、栽培和增產(chǎn)提供了新的挑戰(zhàn)和機遇。目前，我國有大量的鹽堿和干旱土地待開發(fā)和利用，因此利用現(xiàn)代作物分子設(shè)計育種技術(shù)，培育轉(zhuǎn)基因耐旱耐鹽堿棉花新品種，對充分利用干旱和鹽堿地，促進棉花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及保障我國經(jīng)濟和社會發(fā)展具有重要意義。
　　作物在干旱

2、和鹽堿等非生物逆境脅迫條件下，通常表現(xiàn)為生長減慢、早衰和減產(chǎn)等現(xiàn)象。通過對在干旱和鹽堿土壤中生長的植物的研究發(fā)現(xiàn)，植物能通過多條途徑應(yīng)對非生物逆境脅迫，例如增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、調(diào)控細胞周期加速細胞分裂與生長等。研究發(fā)現(xiàn)，甜菜堿是一種比較理想的非毒性滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)細胞滲透壓，穩(wěn)定細胞生物大分子的結(jié)構(gòu)等功能，而CMO和BADH是植物中甜菜堿合成途徑相關(guān)的兩個關(guān)鍵基因;NEK6基因編碼一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，具有調(diào)控植物細胞周期蛋白基因

3、表達和乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能，與植物抵抗逆境脅迫相關(guān)。本文通過提高植物體內(nèi)甜菜堿的累積以及AtNEK6基因的表達兩條途徑，來提高煙草和棉花的耐旱耐鹽堿能力，為培育轉(zhuǎn)基因耐旱耐鹽堿新材料提供依據(jù)。本研究取得的進展如下:
　　1、分別將AhCMO-AhBADH雙基因和AhCMO和AhBADH單基因克隆到pBI121載體，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達載體，轉(zhuǎn)化煙草并獲得T2代轉(zhuǎn)基因后代。通過qRT-PCR分析，轉(zhuǎn)基因煙草中基因均表達。甜菜堿檢測結(jié)果表明，

4、轉(zhuǎn)基因植株的甜菜堿含量相對于對照都有所提高，其中轉(zhuǎn)雙基因株系的甜菜堿含量是轉(zhuǎn)單基因株系的2.1倍，是野生型的10.9倍。在1/2MS培養(yǎng)基中添加200 mM的甘露醇和150mM的NaCl進行干旱和鹽脅迫處理煙草，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株的根長和側(cè)根數(shù)都比對照表現(xiàn)好，而且轉(zhuǎn)雙基因株系的根長較單基因株系分別提高了24.2％和26.5％，側(cè)根數(shù)分別提高了47.2％和58.5％。在盆栽試驗中，轉(zhuǎn)基因植株長勢好于對照，轉(zhuǎn)雙基因植株的鮮重較單基因植株分別

5、提高33.8％和34.7％。
　　同時，對甘露醇和NaCl處理的轉(zhuǎn)基因植株分別測定了細胞滲透壓、葉綠素?zé)晒鈪?shù)、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性及丙二醇和脯氨酸的含量。滲透壓分析結(jié)果表明，甘露醇和NaCl處理可以顯著提高植株細胞的滲透壓，轉(zhuǎn)基因植株滲透壓高于對照植株，其中雙基因植株的滲透壓較單基因植株分別提高了56.3％和51.3％;葉綠素?zé)晒鈪?shù)實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株的光合生理狀況優(yōu)于對照，轉(zhuǎn)雙基因植株優(yōu)于轉(zhuǎn)單基因植株;超氧化物

6、歧化酶和過氧化氫酶活性分析表明，轉(zhuǎn)基因植株在脅迫環(huán)境中分解過氧化氫和超氧化物等有害物質(zhì)的能力強于對照，轉(zhuǎn)雙基因植株又強于單基因植物;丙二醛測定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)雙基因植株含量最低，說明植株的膜脂過氧化程度最低，單價植株次之，對照最高。同時，通過轉(zhuǎn)雙基因還有效提高了逆境下細胞脯氨酸濃度。所以，雙基因共同作用使植物在逆境中遭受的損害最小。
　　通過對轉(zhuǎn)基因煙草的耐旱耐鹽性的系統(tǒng)研究，證明了將AhCMO和AhBADH基因同時導(dǎo)入煙草中表達，能

7、夠顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐旱耐鹽性。在此基礎(chǔ)上，本研究將兩個基因同時導(dǎo)入棉花，培育耐旱耐鹽堿轉(zhuǎn)基因棉花，目前已經(jīng)獲得20株轉(zhuǎn)基因棉花植株。
　　2、將AtNEK6基因?qū)霟煵?，獲得T2代轉(zhuǎn)基因株系。qRT-PCR分析結(jié)果表明，基因在煙草中表達，在非脅迫處理下，轉(zhuǎn)基因材料的根長、側(cè)根數(shù)及鮮物質(zhì)較野生型分別提高6.1％、6.3％和5.9％。在脅迫處理下，轉(zhuǎn)基因材料的長勢要好于野生型，甘露醇處理后其根長、側(cè)根數(shù)以及鮮物質(zhì)重分別是野生型的2

8、.0倍、1.7倍和2.3倍;NaCl處理后分別是野生型的2.1、2.0和2.3倍。葉綠素?zé)晒鈪?shù)實驗結(jié)果顯示，脅迫下轉(zhuǎn)基因植株的光合生理狀況同樣優(yōu)于野生型。SOD，CAT的酶活測定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因材料清除過氧化氫和超氧化物等有害物質(zhì)的能力高于野生型;MDA的檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因材料的膜脂受損程度要低于野生型;同時轉(zhuǎn)基因材料的脯氨酸的含量均高于野生型。
　　AtNEK6轉(zhuǎn)基因煙草的耐旱耐鹽性研究結(jié)果表明，過表達AtNEK6基因不僅可

9、以提高轉(zhuǎn)基因煙草在正常條件下的生物量，同時也可提高其在逆境下的耐鹽耐旱性。因此，在此基礎(chǔ)上，本研究將AtNEK6基因?qū)朊藁?，目前已獲得了轉(zhuǎn)基因胚性愈傷組織。
　　總之，本研究利用煙草對植物兩種抵非生物抗逆境脅迫機制的相關(guān)基因進行了系統(tǒng)的研究，證實了AhCMO和AhBADH以及AtNEK6基因顯著提高煙草對干旱和鹽堿的抵抗能力，并分別將這些基因?qū)肓嗣藁ǎ瑸榕嘤秃的望}轉(zhuǎn)基因棉花品種提供了理論基礎(chǔ)，為同時利用不同抵抗非生物逆境途徑