腫瘤和動脈血栓發(fā)病機制探討及改進治療策略的研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　第一部分：婦科惡性腫瘤
　　一、MTA2基因與上皮性卵巢癌發(fā)生和發(fā)展的相關(guān)性研究
　　目的：探討MTA2(Metastasis-associated gene)基因在上皮性卵巢癌中發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　方法：應(yīng)用RT-PCR和Western blot檢測4株卵巢癌細胞MTA2 mRNA和蛋白質(zhì)的表達；應(yīng)用免疫組化方法檢測68例臨床卵巢組織標本MTA2蛋白的表達并評價其與上皮性卵巢癌分期、

2、分級的關(guān)系。
　　結(jié)果：MTA2基因在侵襲性強的SW626、A27細胞株中的表達顯著高于其在侵襲性較弱的CAOV3、OVCAR3細胞株(p<0.01)的表達；MTA2在交界性和惡性上皮性卵巢癌中的表達高于良性上皮性卵巢癌和正常卵巢組織(p<0.01),惡性上皮性卵巢癌顯著高于交接性腫瘤,良性上皮性卵巢癌和正常卵巢組織之間則無明顯差異(p>0.05)；隨著手術(shù)分期愈晚和細胞分級愈高,MTA2表達愈強(p<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原

3、發(fā)癌灶MTA2表達較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶顯著升高(p<0.01)。
　　結(jié)論：MTA2基因參與惡性上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展,可作為對惡性上皮性卵巢癌病情程度進行評價的指標之一。
　　二、腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白2抑制上皮鈣粘連素在上皮性卵巢癌中的表達及意義
　　目的：探討腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白2(MTA2)參與卵巢癌進展的機制。
　　方法：使用Western-blot檢測27例上皮性卵巢癌中MTA2蛋白和E-Cadherin表達

4、；利用反義技術(shù)敲除MTA2在上皮性卵巢癌細胞株中的表達,采用MTT法檢測細胞增殖；劃痕實驗檢測細胞爬行能力；軟瓊脂集落實驗觀察細胞錨著不依賴生長行為的改變。
　　結(jié)果：MTA2在E-Cadherin陰性的卵巢癌組織中表達明顯高于E-Cadherin陽性的卵巢癌組織,p<0.001。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染反義MTA2 (MTA2as)上皮性卵巢癌細胞A2780較轉(zhuǎn)染空載體的細胞,MTA2表達丟失81.4％，E-Cadherin表達恢復(fù),且細胞增殖

5、能力明顯減弱,細胞爬行能力和軟瓊脂集落形成能力降低。
　　結(jié)論：在在上皮性卵巢癌組織中MTA2基因的表達與E-Cadherin的表達呈負相關(guān)；利用反義RNA技術(shù)抑制MTA2可逆轉(zhuǎn)卵巢癌細胞E-cadherin表達及抑制細胞增殖及轉(zhuǎn)移。
　　三、子宮內(nèi)膜癌治療的臨床探討
　　目的：探討Ⅰ期子宮內(nèi)膜癌(endometrial cancer，EC))的手術(shù)方式以及術(shù)后激素治療和放療的必要性。
　　方法：對1990年1月

6、到1998年12月我院收治的67例EC患者進行回顧性分析,其中Ⅰ期37例、Ⅱ期8例、Ⅲ期14例、Ⅳ期8例；根據(jù)手術(shù)方式不同,將Ⅰ期患者分為3組,行次廣泛／廣泛子宮及附件切除術(shù)和腹膜后淋巴結(jié)清掃術(shù)或腹膜后淋巴結(jié)取樣術(shù)為A組(24例),行次廣泛子宮及附件切除術(shù)為B組(5例),行全子宮及附件切除術(shù)和腹膜后淋巴結(jié)清掃術(shù)為C組(8例),分析3組的生存情況；比較激素治療、放療對Ⅰ期患者預(yù)后的影響；對5例復(fù)發(fā)和13例死亡病例進行復(fù)發(fā)部位探討和死亡原因

7、分析；分析各種輔助性治療的副作用。
　　結(jié)果：壽命表法計算總體5年生存率為78.99％,Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者的5年生存率分別為88.65％、86.67％、77.92％和28.57％,Ⅲ期較文獻報道高；細胞分級G3、深肌層侵犯、非子宮內(nèi)膜樣癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的高危因素(p<0.05),Ⅰ期有高危因素的5年生存率(80％)顯著低于無高危因素組(100％),p=0.022；A、B和C三組之間無明顯生存差異(p>0.05),但

8、A組手術(shù)方式有利于正確分期,發(fā)現(xiàn)12.28％(7/57)患者手術(shù)病理分期升級；Ⅰ期患者激素治療的5年生存率(100％)顯著高于無輔助性治療對照組(86.67％),放療(88.89％)與無輔助性治療對照組之間無明顯差異；Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期3年復(fù)發(fā)率分別為2.7％(1/37)、12.5％(1/8)和7.2％(1/14)；盆腔復(fù)發(fā)占60％,盆腔外為40％；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期5年內(nèi)死亡率為10.81％％(4/37)、12.5％(1/8)、21.43％(

9、3/14)和50％(4/8),其中84.62％(11/13)為病因特異性死亡,7.69％(1/13)為放射性腸梗阻,7.69％(1/13)為心血管并發(fā)癥；激素治療副作用較放療為輕。
　　結(jié)論：A組手術(shù)方式可明確分期,指導(dǎo)治療,但擴大的手術(shù)范圍和腹膜后淋巴結(jié)清掃或取樣不作為Ⅰ期患者的治療手段,術(shù)后仍應(yīng)給予恰當?shù)妮o助性治療；激素治療有利于改善Ⅰ期患者的預(yù)后,放療的必要性則有待探討。
　　第二部分：動脈血栓
　　一、ADAM

10、TS13中遠側(cè)羧基末端結(jié)構(gòu)域的功能研究
　　研究背景：血管性血友病因子裂解酶(ADAMTS13)選擇性切割血管性血友病因子(von Wilebrand Factor，vWF)中央A2結(jié)構(gòu)域Tyr1605-Met1606鍵,但體外用血漿vWF為底物檢測ADAMTS13的活性需將vWF經(jīng)化學(xué)試劑變性劑預(yù)處理。截除ADAMTS13羧基末端結(jié)構(gòu)域(TSP1重復(fù)序列2-8和CUB域)不影響ADAMTS13降解此變性vWF的酶活性。然而,AD

11、AMTS13羧基末端結(jié)構(gòu)域是否在體內(nèi)或有剪切力作用下具有識別vWF的功能則頗有爭議。更有甚者,尚無簡單有效的方法檢測ADAMTS13切割天然血漿vWF的酶活性。
　　方法：本課題首先在人胚腎上皮細胞HEK293細胞株中表達并從其培養(yǎng)液中純化ADAMTS13及羧基末端截斷體等重組蛋白；采用Dr.Tsai方法檢測ADAMTS13及其羧基末端截斷體切割變性vWF的能力；在Dr.Tsai方法的基礎(chǔ)上發(fā)展簡易Flow Based ADAMT

12、S13酶活性檢測法,該方法利用迷你振蕩器產(chǎn)生渦流剪切力協(xié)助改變vWF多聚體的空間構(gòu)象,建立新的方法檢測并比較ADAMTS13和其截斷體酶活性；應(yīng)用傳統(tǒng)的直接結(jié)合實驗(酶聯(lián)免疫吸附實驗)和pull-down實驗研究vWF耦聯(lián)到一定固體介質(zhì)后,截除CUB域(delCUB)或進一步截除TSP1重復(fù)序列2-8(MDTCS)對ADAMTS13與vWF相互作用親和力的影響；同時采用基于表面等離子共振技術(shù)的在生物大分子分析儀BIAcore,模擬生理剪

13、切力,實時定量檢測溶液中vWF和ADAMTS13或其截斷體之間的相互作用,了解ADAMTS13中遠側(cè)羧基末端結(jié)構(gòu)域在流體狀態(tài)下參與底物識別的功能；進一步在HEK293細胞株中表達并純化中遠側(cè)羧基末端重組蛋白(CUB、T2-8、T5-8、T5-8CUB和T2-8CUB),在BIAcore中觀察其與vWF的親和力,及應(yīng)用上述新方法檢測其對全長ADAMTS13(FL-A13)切割天然vWF酶活性的抑制效果。
　　結(jié)果：本研究證實在迷你振

14、蕩器產(chǎn)生的渦流剪切力作用下,ADAMTS13可切割天然血漿vWF,而且切割的效率與震蕩的速度和酶濃度成正比。此方法可在正常人而不是血栓性血小板減少性紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP)患者的血漿中檢測到ADAMTS13活性。盡管ADAMTS13羧基末端截斷體delCUB和MDTCS可同樣有效結(jié)合耦聯(lián)固定的vWF及酶解變性vWF,但二者在有剪切力存在下與溶液中天然血漿vWF的親和力顯著減弱

15、或缺失(BIAcore),且喪失了切割天然血漿vWF的能力(迷你振蕩器)。本研究發(fā)現(xiàn)CUB域重組蛋白不足以與溶液中vWF結(jié)合及抑制FL-A13在渦流剪切力作用下切割天然血漿vWF的酶活性,而在CUB多肽序列的基礎(chǔ)上增加其N-末端TSP1重復(fù)序列5-8 (T5-8CUB)或進一步TSP1重復(fù)序列2-8(T2-8CUB)則恢復(fù)重組蛋白與溶液中vWF結(jié)合的能力,并可抑制在渦流剪切力下FL-A13降解天然血漿vWF的酶活性。
　　結(jié)論：本

16、研究成功建立體外研究ADAMTS13降解天然血漿vWF的新方法,此方法操作簡便,具有潛在的臨床應(yīng)用前景；ADAMTS13中(TSP1重復(fù)序列2-8)遠(CUB域)側(cè)羧基末端結(jié)構(gòu)域的協(xié)同活性對在流動狀態(tài)下ADAMTS13識別并切割vWF至關(guān)重要。
　　二、經(jīng)皮冠狀動脈介入圍手術(shù)期比盧伐定抗血小板活性的研究
　　目的：觀察比盧伐定在經(jīng)皮冠狀動脈介入(percutaneous coronary intervention，PCI)治

17、療中的抗血小板功能。 方法：以近2年進行選擇性PCI的22例患者為研究對象,常規(guī)給予比盧伐定(首劑0.75mg/kg+1.75mg/kg/h)，PCI結(jié)束時停藥,分別在比盧伐定首劑前(基線)、比伐盧定首劑后5-10min(5min PCI)、30min后或PCI結(jié)束時(如果PCI在比盧伐定首劑后30min內(nèi)結(jié)束)(30min PCI)、比伐盧定滴注終止后5min (5min POST)、15min (15min POST)和2h

18、(2h POST)采集患者靜脈血,應(yīng)用LC/MS/MS法檢測血藥濃度；血小板聚集實驗觀察比盧伐定滴注對患者血小板聚集功能的影響；應(yīng)用流式細胞儀檢測血小板表面完整的蛋白酶激活受體1 (protease activated receptor 1，PAR1),評價PCI過程中比盧伐定防止血小板表面PAR1被切割的能力。
　　結(jié)果：按目前臨床使用的劑量方案,比盧伐定在穩(wěn)定狀態(tài)下的平均血藥濃度2.7±0.5μM。這一血藥濃度顯著抑制外源性凝

19、血酶引起的血小板富集血漿(platelet rich plasma，PRP)中血小板聚集,但對PAR1和PAR4特異性多肽致聚劑SFLLRN和AYPGKF誘導(dǎo)的血小板聚集無明顯影響,比盧伐定在PCI過程中可防止凝血酶切割PAR1。比盧伐定滴注后患者凝血酶EC 50(引起50％血小板聚集所需的凝血酶濃度)提高26倍。同樣,在健康捐血者PRP加入外源性比盧伐定可對凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集產(chǎn)生抑制作用,且與比盧伐定濃度呈線性正相關(guān)。根據(jù)健康捐血

20、者繪制的比盧伐定濃度效應(yīng)曲線,計算出PCI患者比盧伐定起始給藥后30min或PCI結(jié)束時的平均血藥濃度與經(jīng)LC/MS/MS法實際測量值僅差11％。停藥后比盧伐定被迅速從血漿中清除,半衰期為29.3min。
　　結(jié)論：比盧伐定可產(chǎn)生濃度相關(guān)的可預(yù)期的抗血小板活性,血小板聚集實驗潛在地可用于臨床評價比盧伐定有效血藥濃度和血小板功能狀態(tài)；比盧伐定半衰期短,易于控制,或可解釋其相對減少的PCI圍手術(shù)期大出血的發(fā)生。
　　三、比盧伐定

21、抑制I型膠原依賴的血小板促凝活性和凝血酶生成的研究
　　目的：觀察經(jīng)皮冠狀動脈介入(pecutaneous coronary intervention，PCI)圍手術(shù)期比盧伐定抑制血小板促凝活性和凝血酶生成的作用。
　　方法：以近2年進行選擇性PCI的22例患者為研究對象,常規(guī)給予比盧伐定(首劑0.75mg/kg+1.75mg/kg/h)，PCI結(jié)束時停藥,在3個連續(xù)時間點(給藥前,首劑開始后30 min或PCI結(jié)束時和停藥

22、后2 h)采集22例PCI患者靜脈血,應(yīng)用ELISA檢測血漿凝血酶-抗凝血酶Ⅲ復(fù)合物(thrombin-antithrombinⅢ，TAT),并比較前兩個時間點Ⅰ型膠原刺激下的血小板聚集功能和通過流式細胞儀檢測Annexin V陽性血小板百分比以評價血小板促凝活性。凝血酶發(fā)光底物S2238被用來體外檢測PRP中Ⅰ型膠原誘導(dǎo)的凝血酶生成。
　　結(jié)果：在PCI過程中,比盧伐定滴注可使TAT濃度降低50％以上和Ⅰ型膠原誘導(dǎo)的血小板聚集率