枯草芽孢桿菌胞外蛋白酶突變株的篩選及其拮抗作用.pdf

1、芽孢桿菌(Bacillus spp．)是土壤和植物微生態(tài)系統(tǒng)中的優(yōu)勢微生物種群，具有很強的抗逆能力和抗病作用，其生防機制主要包括競爭作用、拮抗作用和誘導(dǎo)植物抗病性等方面。其產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶(如蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、β-1.3-葡聚糖酶等)是重要的拮抗物質(zhì)之一。已有研究表明，幾丁質(zhì)酶(Chitinase)和β-1.3-葡聚糖酶(β-1.3-glucanase)在生防中的作用與真菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)有關(guān)。真菌細(xì)胞壁成分較復(fù)雜，除了幾丁質(zhì)、β-1.3-

2、葡聚糖以外，還含有多種蛋白質(zhì)。生防芽孢桿菌產(chǎn)生的胞外蛋白酶可能在協(xié)同幾丁質(zhì)酶、β1.3-葡聚糖酶降解真菌細(xì)胞壁、拮抗病原真菌中起到重要作用。 本研究首先從真菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì)含量入手，對引起山東省主要作物病害的7種病原真菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì)含量進(jìn)行分析，研究了7株生防芽孢桿菌對不同病原真菌的生物防治效果與其3種主要細(xì)胞壁降解酶活力的相關(guān)性，并進(jìn)一步利用紫外線(UV)、硫酸二乙酯(DES)及微波(Microwave)對一株具有廣譜抗菌活性且

3、產(chǎn)蛋白酶的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)T2進(jìn)行誘變，以蛋白酶活力變化為篩選指標(biāo)，研究突變株和出發(fā)菌株對病原真菌拮抗作用的變化及粗酶液對菌絲和孢子萌發(fā)的影響，以期探明芽孢桿菌胞外蛋白酶在生防中的地位和作用，為優(yōu)良拮抗芽孢桿菌的直接利用和菌株的遺傳改良提供依據(jù)。具體結(jié)果如下： 1.采用Bradford法測定真菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì)含量。結(jié)果顯示：供試7種病原真菌細(xì)胞壁交聯(lián)蛋白含量均高于未交聯(lián)蛋白，不同病菌菌絲細(xì)胞壁中總

4、蛋白含量存在差異，其中以棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f．sp．vasinfectum)含量最高，達(dá)到7.411 mg/g；西瓜枯萎病菌(．Fusarium oxysporum f．sp．niveum)、黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f．sp．cucumerinum)，小麥紋枯病菌(Rhizoctonia cerealis)含量相當(dāng)，其次為煙草赤星病菌(Alternaria alternata

5、)和小麥赤霉病菌(Fusariumeraminearum)，番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)含量較少，為2.626 mg/g。 2.生防芽孢桿菌的防治效果與菌株細(xì)胞壁降解酶活力的相關(guān)性研究，是建立芽孢桿菌菌株篩選模型和菌株改良的基礎(chǔ)。根據(jù)供試7株生防芽孢桿菌的防效和細(xì)胞壁降解酶活力，計算相關(guān)系數(shù)。結(jié)果顯示：細(xì)胞壁降解酶中影響其防效的主要因素是菌株的蛋白酶水平，同β-1.3-葡聚糖酶水平、幾丁質(zhì)酶水平也有一定關(guān)系。

6、以細(xì)胞壁蛋白含量最高的棉花枯萎病菌(F oxysporum f．sp．vasinfectum)為靶標(biāo)時，蛋白酶水平相關(guān)系數(shù)達(dá)0.915，其余相關(guān)系數(shù)分別為β-1.3-葡聚糖酶0.811，幾丁質(zhì)酶0.572，對黃瓜枯萎病菌(F.oxysporum f．sp．cucumerinum)、小麥赤霉病菌(F.graminearum)及煙草赤星病菌(A．a(chǎn)lternata)的研究也得到相同結(jié)論；以西瓜枯萎病菌(F.oxysporum f．sp．ni

7、veum)為靶標(biāo)時，菌株幾丁質(zhì)酶水平與其生防效果相關(guān)性較好，相關(guān)系數(shù)為0.824，其余相關(guān)系數(shù)分別為蛋白酶0.623，β-1.3-葡聚糖酶0.497。 3.利用紫外線(UV)、硫酸二乙酯(DES)和微波(Microwave)對枯草芽孢桿菌B．subtilis T2進(jìn)行誘變，獲得了具有良好遺傳穩(wěn)定性的蛋白酶正負(fù)突變株。酶活力測定結(jié)果顯示：與出發(fā)菌株相比，培養(yǎng)48 h的正突變株T2-18胞外蛋白酶活力提高108.5％，負(fù)突變株T2

8、-2蛋白酶活力降低81.1％，而二者的幾丁質(zhì)酶和β-1.3-葡聚糖酶活力均無顯著變化。 4.為明確芽孢桿菌胞外蛋白酶在生防作用中的地位及作用，本研究對突變株拮抗性能的變化進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示：正突變株對棉花枯萎病菌(F.oxysporum f．sp．vasinfectum)的平板拮抗作用增強，其粗酶液可使該菌菌絲變形膨大成珠狀、原生質(zhì)濃縮，萌發(fā)的孢子芽管短且畸形膨大；負(fù)突變株對該菌的平板拮抗作用顯著降低，粗酶液對該菌菌絲和孢子的

9、形態(tài)無明顯作用。盆栽實驗顯示：突變株對黃瓜枯萎病的防效存在差異，正突變株T2-18浸種處理的黃瓜苗死亡率僅為40.0％，T2處理組死亡率為54.3％，低于負(fù)突變株78.6％和對照處理組80.1％。表明提高生防芽孢桿菌胞外蛋白酶的活力可增強其拮抗病原真菌的能力。 5.將突變株在平板上連續(xù)傳20代，考察其遺傳穩(wěn)定性。結(jié)果顯示：突變株產(chǎn)酶能力以及對病原真菌的拮抗作用均無明顯變化，表明獲得的突變株具有良好的遺傳穩(wěn)定性，這對于其在各種生態(tài)